乳腺病变剪切波弹性模量与病理基础的相关性研究引言乳腺癌具有较高的发病率和死亡率,在女性因癌症导致的死亡率中,乳腺癌居第一位,严重威胁着女性的健康[1]。超声检查是乳腺疾病最常用的影像学检查方法,近年来弹性成像的应用,使得常规超声对乳腺病变的诊断特异性有了一定的提升[2-4]。剪切波弹性成像(Shear Wave Elastrography,SWE)作为弹性成像方式中应用较广泛的一种,对于软组织弹性的显示有着定量、可视化且实时显示的优点[5],其在乳腺良恶性病变的鉴别中有着重要的价值[6]。大多数乳腺恶性病变的硬度明显高于良性病变[7],但恶性病变硬度高于良性病变的具体原因还未明确。肿瘤的生长是一个复杂的过程,乳腺病变的硬度也不会只与单一的因素相关,与病变中的细胞数量、胶原纤维的含量,组织学上的特点等都可能具有相关性。找到乳腺病变硬度的相关因素,就更容易理解硬度在临床应用中的价值。本实验拟应用SWE技术对乳腺穿刺患者病变的弹性模量值进行测量,穿刺后对标本进行常规HE染色做出病理诊断及统计细胞总数、Masson染色测定胶原纤维的含量、血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)[8]免疫组化染色估算血管密度。应用统计学的方法分析各个因素与剪切波弹性模量的相关性,探究乳腺病灶硬度产生的原因,丰富硬度在临床应用中的价值。 1 材料与方法1.1 临床资料2018年9月至2019年3月来中国医科大学附属盛京医院接受超声引导下乳腺结节粗针穿刺的患者42例(经GPower3.1软件估算样本量),术前均行常规超声检查及剪切波弹性成像检查,术后对所有患者的穿刺病理标本进行HE染色做出病理诊断并计数细胞数量,同时对切片进行Masson染色及VEGF免疫组化染色,患者年龄20~86岁,平均(45.9±15.9)岁。病灶最大径0.6~5.8 cm,平均(2.6±1.3) cm。患者均签署知情同意书。 1.2 仪器与方法剪切波弹性成像检测:选用SuperSonic Imagine公司AixPlorer超声诊断仪,探头频率4~15 MHz。常规超声检查结束后切换到剪切波弹性成像检查的模式,在测量剪切波弹性模量值时要避免外界的压力,嘱患者屏住呼吸几秒钟并保持安静。质控的标准是感兴趣区上方呈均一的蓝色,表示没有外界的压力,为使感兴趣区上方呈均一的蓝色,我们可以通过轻提探头来实现,当感兴趣区上方出现其他颜色时,轻提探头调整此部位的压力,静置3 s,使图像稳定后,定帧,横纵切面各存三张图。之后用Sonic软件分析,点击Q-BOXratio或Trace键,手动定义感兴趣区,用直径为2 mm大的感兴趣区先后选取病灶内最硬的部位及病灶旁边正常的乳腺组织,由系统自动计算出该感兴趣区的弹性模量最大值、平均值、最小值及病灶与周围组织比值,每个病灶进行6次测量,最后记录6次测量结果的平均值。 病灶内细胞数量测定:将乳腺组织包埋,切片,脱蜡至水,行HE染色,脱水,透明,中性树胶封固,镜下观察。Image-ProPlus6.0图像处理软件进行定量分析,在高倍镜(×400)下,按照随机选取的方式在每一张细胞切片上选定5个视野,计算每一视野中细胞的总数,计算平均值。 病灶内胶原纤维含量测定:将切片脱蜡至水,行Masson染色,脱水,透明,中性树胶封固,镜下观察。镜下胶原纤维呈蓝色;红细胞、胞质、纤维素等呈红色;细胞核呈蓝褐色。对胶原纤维的定量分析:Image-ProPlus6.0图像处理软件进行定量分析,在高倍镜(×400)下,按照随机选取的方式在每一张细胞切片上选定5个视野,计算每一视野中胶原纤维累加面积,计算平均值。 病灶内VEGF表达水平测定:将切片脱蜡至水,行VEGF免疫组化染色,脱水,透明,中性树胶封固,镜下观察。细胞内若出现棕黄色颗粒则定义为阳性细胞,将阳性细胞所占的百分比和显色强度结合评分。在高倍镜(×400)下,按照随机选取的方式在每一张细胞切片上选定5个视野,每个视野计数100个细胞,计算阳性细胞所占百分比。阳性细胞所占比例≥75%为4分;50%~75%为3分;25%~50%为2分;1%~25%为1分;<1%为0分。显色强度评分:棕褐色为3分;黄色至棕黄色为2分;浅黄色为1分;无着色为0分。两种评分结果相乘,得出VEGF的表达水平[8],乘积≤1分定义为阴性表达,>1分定义为阳性表达。 以上染色结果的判定,由病理科2名医师共同完成,工作时对患者乳腺病变的SWE结果均不了解。 1.3 统计学方法应用SPSS 17.0软件进行统计学分析,计量资料以均±值标准差(±s)表示,恶性组及良性组病灶的弹性模量、细胞数目、胶原纤维面积及VEGF的表达水平比较采用t检验,弹性模量与细胞数目、胶原纤维含量及VEGF表达水平的相关性采用Pearson相关性分析,P<0.05表示差异有统计学意义。 2 结果2.1 良恶性乳腺病变的弹性模量值在42例乳腺病变中,恶性病变23例(54.7%),良性病变19例(45.3%)。乳腺恶性病变弹性模量最大值、平均值、最小值及病灶与周围组织比值分别(143.56±69.41)、(119.97±66.25)、(84.75±58.51) kPa 及(12.03±7.71)明显高于良性病变的(50.1±26.91)、(38.18±22.53)、(25.81±18.85) kPa及(3.50±3.19)(t=5.526、5.133、4.206、4.503,P<0.001),见表 1。 表1 良恶性乳腺病变的弹性模量值对比 病变性质 最大值/kPa 平均值/kPa最小值/kPa 弹性比值恶性病变143.56±69.41 119.97±66.25 84.75±58.51 12.03±7.71 3.50±3.19 t值 5.526 5.133 4.206 4.503 P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001良性病变50.1±26.91 38.18±22.53 25.81±18.85 2.2 良恶性乳腺病变弹性模量值与病理基础的相关性分析恶性病变中的细胞数目(502.57±167.698)个,明显小于良性病变中的细胞数目(838.11±211.886)个(t=5.371,P<0.01)。弹性模量最大值与细胞数目呈线性负相关(r=-0.630,P<0.01)。恶性病变中胶原纤维的面积(70114.69±13678.26) μm2明显大于良性病变中胶原纤维的面积(47022.47±15051.32) μm2(t=5.156,P<0.01),弹性模量最大值与胶原纤维含量呈线性正相关(r=0.646,P<0.01)。在23例恶性病例中VEGF阳性表达率为82.61%(19/23),在19例乳腺良性疾病中VEGF阳性表达率为15.8%(3/19)。VEGF蛋白在乳腺恶性病变中表达明显高于乳腺良性病变(P<0.05)。在VEGF蛋白表达阳性的病例中进行Pearson相关分析,弹性模量最大值、平均值、最小值及比值均与VEGF蛋白表达无明显相关关系(图1~3)。 图1 乳腺浸润性导管癌肿块的病理图 注:a. 剪切波弹性成像显示病变(白色空心箭头所指)的弹性模量最大值较高,为104.6 kPa;b. HE染色细胞数目(黑色实心箭头所指为细胞核)较少(×400);c. Masson染色蓝色部分(白色实心箭头所指)为胶原纤维,所占面积较大(×400);d. VEGF免疫组化染色(红色实心箭头所指细胞浆呈棕褐色)表示VEGF 表达阳性(×400)。 图2 乳腺腺病肿块的病理图片 注:a. 剪切波弹性成像显示病变(白色空心箭头所指)的弹性模量最大值较低,为16.7 kPa;b. HE染色细胞数目(黑色实心箭头所指为细胞核)较多(×400);c. Masson染色蓝色部分(白色实心箭头所指)为胶原纤维,所占面积较小(×400);d. VEGF免疫组化染色(红色实心箭头所指细胞核以外部分无棕褐色着色),表示VEGF 表达阴性(×200)。 图3 乳腺病变剪切波弹性模量最大值与病理基础相关性的散点图 注:a. 细胞数目;b. 胶原纤维面积。 3 讨论乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤[9],早期发现、早期诊断尤为重要。在超声诊断中,硬度的增加在恶性病变与良性病变的鉴别中有着重要的辅助价值[10-11]。本研究通过对乳腺病变剪切波弹性模量值的定量分析发现,乳腺恶性病变的弹性模量最大值、平均值、最小值、病灶与周围组织弹性模量比值均高于良性病变,与先前其他学者的研究结果大致相符[6,12-14],证实了剪切波弹性成像在乳腺良恶性病变鉴别中的重要作用。 为探究硬度产生的原因,本研究对乳腺病变的弹性模量值与病变内细胞数量,胶原纤维含量,血管内皮细胞生长因子表达水平进行相关性分析,发现乳腺病变的弹性模量值与病变中细胞的数量呈负相关,与胶原纤维的含量呈正相关,与血管内皮细胞生长因子表达无明显相关关系。证明了乳腺病变硬度与胶原纤维含量之间密切的相关关系,胶原纤维作为构成乳腺恶性病变细胞外基质纤维成分中含量最多的成分,其不仅在构成细胞外基质的主要骨架[15],增加肿块的硬度,支撑肿块维持一定形态中具有关键作用,研究表明其在肿瘤的生长,侵袭等生物学行为中也发挥着重要的作用[16]。Levental等[17]发现乳腺恶性病变形成的过程中,胶原纤维的表达逐渐增加,细胞外基质的硬度也逐渐变大。实际上,其硬度对细胞的生长、转移有着促进的作用[18]。我们发现病变内细胞数目的增多对乳腺病变硬度的增加无正向作用,也从侧面证明了乳腺病变的硬度主要由间质成分的硬度决定。本研究也证实了恶性病变与良性病变相比含有更多的胶原纤维,所以我们认为乳腺恶性病变硬度增加的病理基础很有可能是胶原纤维的增多,这也可以与恶性肿瘤生长、侵袭的生物学行为相联系,将硬度增加与恶性病变的病理基础建立联系,使我们更容易理解乳腺病变硬度在临床应用中的价值。 有研究还发现乳腺病变的硬度和某些促进胶原纤维表达等的细胞因子也有紧密的联系。Xue等[19]发现乳腺恶性病变中胶原纤维含量及整合素相互作用蛋白(Kindlin-2)的平均表达强度均高于乳腺良性病变,Kindlin-2表达和Emax有相关性并且Kindlin-2和淋巴结的转移有相关性,对于乳腺癌的进展和转移有促进作用。弹性成像可以辅助诊断乳腺恶性病变是否伴有腋下淋巴结的转移[20],对于乳腺恶性病变的分级及对患者的预后判定都有着重要的意义。李万[21]研究发现乳腺恶性病变内转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor β1,TGF-β1)呈高表达,且TGF-β1和胶原纤维含量呈正相关,提示胶原纤维的合成及分泌受TGF-β1的促进。病变的硬度评分也与TGF-β1表达、胶原纤维含量成正相关关系。TGF-β1已被证实可以用作预测乳腺癌患者预后不良的独立预后因子,所以认为硬度的增加也可作为诊断及判断乳腺癌患者预后的因素,将硬度与胶原纤维及与乳腺癌预后相关的细胞因子建立联系,使得硬度在良恶性的鉴别中具有更可靠的依据和更广泛的应用。越来越多的研究证明乳腺病变的弹性成像与病理基础之间具有相关性[22],乳腺恶性病变的硬度与其分级、恶性程度、预后等都具有相关性。 4 结论乳腺病变剪切波弹性模量与病变内胶原纤维含量密切相关,且胶原纤维作为细胞骨架在乳腺癌的疾病发展中扮演重要的角色,这使我们更容易理解硬度在临床应用中的价值,为剪切波弹性模量与乳腺癌的进展、淋巴结转移,预后推测等方面的联系提供一定的帮助。 [1] Chen W,Zheng R,Baade PD,et al.Cancer statistics in China,2015[J].CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-132. 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Correlation between Shear Wave Elastic Modulus and Pathological Basis of Breast Lesions |