自动红细胞比容校正全血CRP测试结果特定蛋白分析仪的系统设计
引言
目前，国内外关于红细胞比容（Hematocrit，HCT）对全血C-反应蛋白（C-Reactive Protein，CRP）检测的影响及其校正方法的研究成果有很多[1-4]，如田野等[2]通过试验得出全血CRP水平与HCT值呈显著负相关关系的结论，并推导了使用HCT值校正全血CRP值的公式。隆维东等[4]测定并计算了最佳理论HCT范围。但能够实现一台设备同时实测HCT及CRP值，并使用HCT值对全血CRP检测结果校正的分析仪却很少。在临床检验科室的测试实践中，当遇到HCT偏离正常值的样品时，不得不人工校正后发布报告。因此，本文设计一款可实现自动测量HCT及CRP值，并进行自动校正的全自动化仪器。
1 系统设计
1.1 工作原理
采用散射比浊法[5-8]设计光学部件，采用散射光对全血样本进行HCT测定，自动对CRP测试值进行校正。
散射光检测原理描述如图1所示，采用650 nm波长的激光I0沿水平轴入射，通过待测样本时，光线被粒子颗粒散射，发生偏转，根据Rayleigh散射方程，散射光强度与粒子（免疫复合物）的浓度和体积成正比，即待测物越多，反应后形成的粒子也越多，散射光强度也越强。通过测量散射光的强度，可计算出待测抗原的浓度。
图1 散射比浊法示意图
1.2 系统结构
本系统主要由机械结构和电路系统组成。
1.2.1 机械结构设计
机械结构组件[9-10]由七大模块组成，分别为：进样架模块、样本针模块、试剂针模块、搅拌针模块、反应盘模块、试剂盘模块、机架模块。机械结构组件分解图如图2所示。
图2 机械结构模块
1.2.1.1 进样架系统
进样架系统主要由进样位、出样位，推动样本架的步进电机、相关导轨、同步带、传感器等组成，当样本架放入进样位后，由步进电机驱动挡片将样本架推至吸样位，完成吸样后，再由挡片将样本架推至出样位，完成自动进样。
1.2.1.2 样本针模块
样本针模块用于将血液样本添加至反应杯中，具有液面探测功能及垂直方向的防撞功能。
1.2.1.3 试剂针模块
试剂针模块用于将试剂盘模块中低温存储的试剂抽吸到反应杯中，同样具有液面探测及垂直方向防撞功能。
1.2.1.4 搅拌针模块
搅拌针模块用于将样本与稀释液，或两者混合液与第二试剂进行混匀，保证充分反应。
1.2.1.5 反应盘模块
反应盘用于承载反应杯，具有加热功能，保证免疫反应处于恒温37℃的环境中。安装有光学测试模块，采用激光光源，激光透过反应杯后，被光学感应模块接收。反应盘带有编码盘，编码盘与传感器组件共同保证反应盘按需求转动到不同位置，进行加样、加试剂、搅拌及测试等工作。
同一样本对HCT及CRP测试时，需要使用两个反应杯，第一反应杯注入稀释液后，样本针将全血样本注入该反应杯中，测定该样本的HCT，测试完成后，由样本针从第一反应杯中吸取一定量样本注入第二反应杯中，由试剂针注入试剂，反应完成后再次使用散射法对第二反应杯中的混合样进行CRP值的测试，并使用第一反应杯中测的HCT对CRP值进行校正。
1.2.1.6 试剂盘模块
试剂盘模块与反应盘模块控制方式类似，同样使用编码盘进行定位和转动控制。为避免在机试剂蒸发或温度原因导致的试剂在机时间缩短，试剂盘配有制冷模块。
1.2.1.7 机架模块
机架模块包含整机的手板件外壳、用于承载其他模块的机加工件或钣金件等。
1.2.2 硬件结构设计
1.2.2.1 设计原则
整机布局应注意大功率器件，应布在电路板边缘，电机、泵、阀驱动电路设计为独立单元，避免大功率器件在启动、运行及停止时产生的噪音影响其他系统的正常运行。仪器电路板较多，运动机构复杂[11-12]，要充分考虑印刷电路板（Printed CircuitBoard Assembly，PCBA）的连接线、风道的设计。电路板与液路应分开，液路采用两段或多段连接的方式，方便拆卸维修。同一逻辑运动下的功能实现应尽量在同一单元内完成，减少PCBA之间的通讯。
1.2.2.2 架构设计
为降低研发风险，提高产品的扩展性，采用目前广泛应用的微处理器ARM（Advanced RISC Machines，ARM）平台[13-14]。ARM单片机与上位机进行通讯，设备运行逻辑、数据计算等由上位机完成。
选用意法半导体的STM32F407V单片机，使用CortexIM-M4为内核作为主控芯片，负责整个硬件平台的指令控制、数据运算及信号处理，通过设备内的光电传感器采集数据，然后通过主控芯片内相应的模块进行信号处理，再通过中央处理器进行算法控制，解析出结果值并在上位机上显示[15-17]。
主控板使用串口与上位机通讯，主控板与各驱动板之间则使用控制器域网（Controller Area Network，CAN）通讯。
上位机与主控板及各模块控制板之间的通讯如图3所示。主控板及各模块控制板实物图如图4～6所示。主控板为控制中枢，包括控制电源，各运动机构的运行逻辑控制等。各模块控制板则用于本模块的驱动及控制，并将结果通过主控板反馈至上位机系统。
2 软件设计
上位机软件负责界面的操作、结果的显示，可进行样本测试、质控测试、定标测试的申请；以及查询、打印等必备的辅助功能。
图3 硬件通讯拓扑
图4 主控板
图5 针类模块控制板
图6 盘类模块控制板
下位机进行时序控制、逻辑控制、数据运算等，将分析后的结果传送到上位机，在上位机显示界面上显示。
上位机软件，人机交互功能的设计如图7所示，软件系统分为菜单、试剂、任务、指控及结果模块。菜单为功能入口，提供各类功能的接入；试剂模块则用于显示试剂剩余量、批号等相关信息；任务入口用于新增测试样本信息的录入，其中需要选择样本为全血标本还是血浆/血清标本；质控则用于仪器质控结果的查看及汇总功能等，同时质控测试时，信息录入也在本窗口；结果则为样本测试结果的汇总显示、查询等。
图7 人机交互功能
在仪器进入工作状态时，主程序首先对仪器的电路进行整机初始化，检查仪器的各运行动作是否异常，在确认无异常后，仪器自动进行日检，日检执行完成后，仪器检测清洗桶清洗液的用量、试剂位等的检测。检测完成后，可进入执行流程环节，流程结束后输出结果。具体流程如图8所示。
图8 系统流程图
3 性能测试与验证
本分析仪采用了良好的人机交互设计，方便操作者使用。仪器的实物图如图9所示。人机交互界面如图10所示。
图9 产品实物图
图10 人机交互界面
3.1 性能验证
CRP存在于人血浆或血清中，HCT会对该项目的测试结果产生较大影响。因此，本仪器设计时，采用散射光对全血样本进行特定蛋白浓度及HCT的测定，实现自动HCT校正全血CRP测试结果。
使用CRP试剂及配套的定标品、质控品及血清样本，对设备进行定标，并进行质控测试，质控通过后，对设备进行准确度、重复性及线性的测试[18-19]。
3.1.1 准确度
仪器准确度采用编号为ERM-DA474/IFCC的CRP标准物质进行测试，靶值为41.2 mg/L。对标准物质测定3次，测试结果记为(xi)，分别为 43.3、43.1、42.8 mg/L计算相对偏差结果分别为5.10%、4.61%和3.88%，按照CRP测定试剂盒行业标准[20]，相对偏差应≤15%。
3.1.2 重复性
使用高、低值临床血清样本对仪器进行测试，计算标准偏差及变异系数，变异系数应当不大于10%[20]，测试结果表明在临床高值样本测试结果CV值为0.79%，低值样本测试结果CV值为3.4%，结果均优于标准要求。
3.1.3 线性
采用高值临床血清样本，按照原倍、1/2、1/4、1/16、1/64、1/400的稀释比例进行线性测试，计算线性相关系数。测试数据结果显示线性相关系数R为0.9998。
通过上述测试表明，在使用血清样本时，本文中设计开发的特定蛋白仪具有良好的实用性。
3.2 全血样本的CRP测试及结果校正
3.2.1 HCT与全血CRP数值的线性关系
对全血CRP进行测试时，对测试结果进行了换算，换算为与血浆样本等值的结果见式(1)。
式中：CRPW-全血CRP浓度值；
CRPWR-全血CRP浓度值实测值；
HCt-固定HCT。
其中Hct值为特定蛋白仪内置可修改参数，一般设置为40%。
将公式(1)编程输入软件系统中，则在测试获得结果后，使用固定的HCT40%自动校正全血测试结果。
由上式可看出，全血CRP浓度值与HCT成线性关系。验证如下。
采集正常体检人员EDTA抗凝血两管，第一管使用3000 r/min离心10 min，第二管静置发生血沉后，用移液枪吸取底层红细胞，或滴加第一管血浆，并充分混匀的方式，分别使用Sysmex XN-2000仪器测试HCT，以及本文所研发的特定蛋白仪测试全血CRP浓度。二者关系如图11所示。
3.2.2 HCT的测定
为实现使用HCT对全血CRP进行校正，本仪器采用散射光测试的方法，获得HCT数值。
全血样本被吸注到预先加入了稀释液的反应杯中，反应盘将该反应杯旋转至测试位，获得散射光强度值，并通过曲线获得HCT值，利用该HCT值进行校正。散射光强度值（为方便表示，对散射光强度进行了换算）与HCT的关系如图12所示。
图11 全血CRP浓度与HCT的线性关系
图12 HCT与散射光强度值
由图12可知，HCT与散射光强度值有线性关系，因此，可使用二者关系建立标准曲线，用于根据散射光强度计算HCT值。
3.2.3 利用HCT对全血CRP的校正
使用3.2.1中以获得的实验数据。根据隆维东[4]等研究结论，校正计算的公式为式(2)。
将公式(2)输入至仪器计算程序中。
取3.2.1中，梯度HCT样本，使用修改了校正公式特定蛋白仪进行全血CRP测定。每个标本测定三次，取平均值列于表1校正值一列。
表1 不同HCT校正CRP值
序号实测值/（mg/L）校正值/（mg/L）相对偏差/%1 5.12 48.23 -1.87 2 11.35 47.65 -3.05 3 21.23 47.88 -2.58 4 34.01 52.2 6.21 5 40.12 51.2 4.17 6 49.11 50.23 2.20 7 59.89 45.32 -7.79 8 84.68 47.88 -2.58 9 92.46 44.5 -9.46 10 105.01 53.8 9.46 11 110.12 55.1 12.11 12 123.46 53.8 9.46 13 135.22 50.8 3.36 14 141.35 46.2 -6.00 15 155.69 49.35 0.41
根据隆维东等[4]的结论，当 HCT 处于（36.0±3.5）%范围时，全血标本在使用式(1)的方式校正时，与血清标本直接测试结果无统计学差异。故以HCT38%样本CRP浓度为该样本真值（49.15 mg/L），使用该真值计算与所有校正值的相对偏差，列于表1相对偏差一列。不同HCT梯度的同一来源样本的CRP测试结果均得到了校正，符合标准要求[20]。
4 结论
本仪器设计的HCT测试功能获取的HCT值精确度虽无法与血球仪精度相媲美，但可以有效的校正CRP的值，浓度值的相对偏差，均小于15%，可以满足临床要求。
本分析仪其进样架系统具有一定的先进和优越性，可以避免人工因素的影响，大幅度提高检测效率；样本针、试剂针和搅拌针，三个模块分工协作，可以极大的提高运行效率；配合清洗部分，可以减少一定耗材损耗，降低使用成本；反应盘和试剂盘模块都采用特殊设计的编码盘，根据任务需求，转动到不同的部位，反应盘配合检测系统，可以准确无误的进行判别，提高诊断的准确性以及检测效率；试剂盘配合冷却模块，可以减少试剂的损耗，降低一定的使用成本。
本分析仪的硬件部分，采取电路板和液路分开布置，电路板以及液路部分都在仪器边缘位置，方便拆卸，对后续的售后维护提供了极大的便利。本分析仪的软件部分，采用良好的人机交互界面，通俗易懂，方便使用者的操作。
本分析仪没有加入闭盖穿刺功能和独立的急诊位，这两个不足之外将会是我们以后研究和完善的方向。量产机可参考本文的设计思路，加入闭盖穿刺、设立急诊位等方便临检的功能。可靠的质量、持续稳定的设备运行，是临检科室的主要要求，新开发的设备，应当进行足够时间的可靠性试验，运行稳定性试验等，在充分验证设备可靠性基础上注册并量产。
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