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乳腺癌是女性排名第一的常见恶性肿瘤。目前乳腺癌的主要影像学检查方法是钼靶、超声和MR[1]。上述检查方法的应用都存在一定的局限性，如钼靶的假阳性率和假阴性率较高，超声诊断依赖于操作者的诊断水平，MR检查费用较高，且在乳腺癌诊断上的应用价值也备受争议[2]。因此急需一种诊断准确、操作简单、成本低廉的检查技术手段。光声成像（Photoacoustic imaging，PA）一种新兴的成像模式，近来引起广泛关注。它的成像原理是短波长幅度调制式或脉冲式激光脉照射生物组织后，部分光能被吸收转变为热能，由于热胀冷缩效应激发产生声波[3]。PA成像将光学成像和超声成像相结合，具有无侵袭性、易操作、高分辨率、高对比度等优势，是未来生物医学领域重要的实时成像技术之一[4]。

在过去几年里，金属纳米结构（如Au、Cu和Pd）在催化、光子学及生物领域引起广泛关注，由此在生物传感、药物传递、肿瘤治疗和分子成像等方面产生大量研究。Au纳米星由于具有可调的等表面离子共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）吸收带、较大的吸收-闪射比和摩尔消光系数，可能更适用于PA成像或光热治疗研究[5-6]。不同形态的金纳米粒子（如壳、棒状、星状和纳米笼）被用于光热治疗或PA成像研究。这些纳米材料具有低光漂白、可调谐SPR特性、在近红外区域强吸收、光热转换效率高等优点[7]。其中，金纳米壳在早期临床研究中被用于头、颈部和前列腺肿瘤的光热治疗。但是，金纳米壳的合成过程较为复杂，金纳米壳在一定时间内很难排出体外，因此限制了其进一步应用[8]。金纳米棒不稳定，在NIR光照射下容易融化[9]。金纳米星的合成方法简单，具有大吸收截面和高吸收散射比，被认为是较为理想的PA成像材料[5-6]。

一般情况下，合成金纳米材料需要使用十六烷基三甲基溴化铵（Cetyltrimethylammonium Bromide，CTAB）。CTAB具有很强的毒性，且很难用PEG置换[9]。本研究中我们使用牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）对纳米粒子行表面包覆。BSA是天然存在的蛋白质，可用于还原和稳定纳米材料[10-11]；BSA含有丰富的官能团，如羧基、氨基和巯基，是较为理想的表面包覆剂。用其合成的纳米粒子具有很好的生物相容性、胶体稳定性，容易进行表面修饰，而且合成方法简单[12-13]。

本研究中，我们将以一种绿色的金种子生长方法制备金纳米星，选择的表征策略包括TEM、DLS、FTIR、UV-vis-NIR吸收波谱等。细胞毒性实验和不同组织病理切片用于评价其生物毒性。最后，本研究建立4T1乳腺癌模型，探索了给药后肿瘤组织PA成像特点。

1 材料与方法

1.1 PA成像系统

Endra Nexus 128 PA断层扫描系统（Endra Nexus128 PA Tomography System）用于成像。该系统配备了可调节的纳秒脉冲激光器（20 Hz，7 ns脉冲，波长680～950 nm）；128个非聚焦超声探头（5 MHz中心频率，3 mm直径）排列成半球形，扫描时内部盛满38℃蒸馏水；一个碗状中央含凸起的托盘置于其上方，用于固定成像部位，见图1。Osirix（OsiriX Foundation, Genève，Switzerland）软件（开放性软件）用于数据处理和图像重建。

1.2 金纳米粒子的制备

本研究采用绿色Au种子生长方法制备金纳米星。Au种子合成：将过量柠檬酸钠水溶液（3.5 mg，0.4 mL）和HAuCl4水溶液（0.25 mmol/L，9 mL）进行混合，置于磁力搅拌器上激烈搅拌。随后，加入冰水预冷的NaBH4水溶液（0.33 mg，0.1 mL）。上述混合液在室温条件下搅拌下2 h，得到Au种子溶液。

金纳米星合成：将Au种子溶液（1.5 mL）、HAuCl4水溶液（45 mg，1.5 mL）、抗坏血酸溶液（50 mg，1 mL）和AgNO3溶液（5 mg，1 mL）混合，缓慢搅拌30 s后，加入BSA溶液（100 mg，10 mL）。室温下搅拌12 h后离心分离（10,000 rpm，10 min），得到金纳米粒子。

1.3 纳米粒子的表征

我们选择TEM观测纳米粒子的大小和形貌，DLS检测粒径分布，分光光度计检测纳米粒子的UV-vis-NIR吸收波谱。

1.4 细胞培养和细胞毒性实验

快速将冻存人肝癌细胞（HepG2）复苏，复苏后离心，去上清，加入含15%胎牛血清DMEM培养基，在37℃和5% CO2条件下孵育。取对数生长期HepG2细胞，用5%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，加入96孔板（约5000个/孔），孵育过夜。随后，吸出原培养基，加入含有不同浓度纳米材料的培养基 200 μL（0.065、0.125、0.25、0.5、1 mmol/L）。对照组只含细胞和细胞培养基。为排除纳米粒子可能对吸光度产生的干扰，在细胞孵育24 h后轻轻吸走上清液，并用PBS溶液清洗三遍。每孔加入CCK8溶液10 μL，至溶液颜色变成深黄色后使用酶标仪TECAN In finite® M1000PRO检测吸光度值（波长450 nm），并计算细胞活性百分比。

1.5 体外PA信号检测

本研究将激发波长设置在金纳米星的SPR峰775 nm。选择小分子PA成像对比剂亚甲蓝作为参照（激发波长700 nm）。将装有不同浓度金纳米星和亚甲蓝溶液的EP管于自制固定器上行扫描成像。于原始断层图像上勾画ROI，记录平均PA信号强度。勾画ROI时尽量保证所选择测量层面的位置相同、大小一致。

1.6 小鼠乳腺癌模型的建立

接种肿瘤前对小鼠背部皮肤脱毛。取对数生长期的4T1肿瘤细胞制成浓度为1×106个/mL的单细胞悬液，每只小鼠左上肢背部皮下接种肿瘤细胞悬液0.2 mL。接种完成后，每天观察接种部位变化情况，每周用游标卡测量肿瘤长径a、短径b、高度c，根据公式：V=(a+b+c)π/s计算肿瘤近似体积。3周后，筛除瘤体过大、过小或者接种失败的小鼠。4T1小鼠乳腺癌模型的成瘤率约为50%。选取6只瘤体大小相近，体积在0.8～1 cm3范围内的荷瘤鼠行成像扫描。

1.7 肿瘤PA成像

Endra Nexus 128 PA 断层扫描系统（Endra，Michigan，USA）用于成像扫描。小鼠腹腔注射2%苯巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，取侧卧位并固定瘤体于扫描中心处，设置激发波长为770 nm，重复时间为3 s。尾静脉给药200 μL（10 mmol/L），于给药前、给药后5 min、30 min、1 h、2 h行动态扫描。上传数据到Osirix Lite系统，行3D MIP重建，半定量化测量肿瘤组织和肿瘤血管的PA信号强度。血管的ROI选取在直径最大的管径处。瘤体的ROI勾画尽量包括整个肿瘤组织，但要尽量避开大血管。不同时间上ROI大小、位置保持基本一致，记录ROI内平均PA信号强度。

1.8 统计学分析

统计学分析采用SPSS 13.0软件, 实验结果用平均值±标准差（

±s）表示，组间差异采用t检验法进行比较。

2 结果

2.1 金纳米粒子的表征

TEM下见纳米粒子呈不规则星状结构，表面见不规则毛刺、凸起，大小分布较为均匀（图2a）。DLS测得平均粒径为86 nm，约95%集中分布在43～91 nm之间，如图2b所示。通过对纳米粒子的吸光度进行检测，发现金纳米星的SPR峰位于775 nm，处于近红外（650～900 nm）区域。

良好的生物相容性是纳米材料活体应用的前提。本研究中我们选择细胞毒性试验评价其体外生物毒性。结果显示，最高给药浓度条件下（1 mmol/L）的细胞活性百分比为94%（图3b），未见明显生物毒性。

2.2 乳腺癌PA成像研究

给药前肿瘤组织PA成像可见腹壁血管显影（图4）。给药后血管信号增强，成像范围变大，且2 h内未见明显变化（图5）。此外，肿瘤组织呈明显不均匀强化，肿瘤内毛细血管可见。1 h后，PA信号强度达到最大，直至2 h后未见明显变化（图6）。

3 讨论

随着纳米医学的快速发展，大量新型纳米材料被用于疾病诊疗研究[14-15]。PA成像一种新兴的成像模式，近来引起人们关注，其在成像分辨率上具有显著优势。PA成像基于生物组织内部光学吸收的差异性，以超声为媒介的一种生物光子成像方法。PA成像过程包括光学激发、超声探测及图像生成。持续短激发脉冲可以使生物组织产生声波。声波强度，即PA信号强度受光源、组织的热学、光学和机械特性等影响。PA成像的激发波可以从紫外波段到红外波段。由于散射或非闪射光都可以产生PA信号，因此深层组织内也可以产生PA信号。PA成像组织的穿透深度在厘米范围，空间分辨率可达微米级别。PA成像可以实现细胞器、细胞、组织再到器官的多维度成像，进而提供结构、功能和分子信息。

外源性造影剂的研发使PA成像的应用扩展到分子成像和基因成像，包括有机染料、报告基因和纳米粒子等。为探索PA成像肿瘤的可行性及其成像特点，本研究构建合成金纳米星。不同形态的金纳米粒子可作为PA造影剂使用，通过将SPR调整到近红外区，可以减少内源性造影剂的光吸收，并提高成像深度。目前，用于PA成像纳米材料的主要问题是合成流程较复查，可重复性较差，部分纳米材料具有毒副作用。目前我们少见将单纯金纳米材料用于PA成像研究。在构建纳米材料的过程中，为降低纳米粒子的生物毒性，提高生物相容性，通常需要在其表面行配体交换或者用两亲聚合物或者脂类表面包覆。常用的聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）包覆过程较为复查，残留的CTAB有一定的生物毒性，且PEG不可生物降解，较难和配体相结合[16]。本研究采用金种子生长方法，以BSA为模板，来构建金纳米星。BSA是天然存在的多肽聚合物，具有高生物相容性、生理条件下高稳定性、低免疫原性、可降解性和存在可修饰的官能团等诸多特点[17-18]。

本研究中金纳米星的平均粒径为86 nm，且大部分粒径在100 nm以下。以往的研究表明，粒径在1～100 nm的纳米材料相对于其他尺寸更适用于活体成像或疾病诊疗等方面应用[19]。金纳米星的SPR峰位于775 nm附近，处于近红外光区（650～900 nm）。氧化血红蛋白、还原血红蛋白和水对近红外光的吸收能力相对较差，因此SPR位于NIR区可以提高成像的组织穿透深度和信号噪声比，更只用于生物组织成像。细胞毒性实验结果表明纳米粒子具有很好的生物相容性。同PEG包覆相比，BSA包覆的纳米材料可能更适用于活体成像应用[9, 20]。

生物组织内有很多内源性PA对比剂，如DNA/RNA、血红蛋白和黑色素。为可视、辨别肿瘤组织和正常组织，通常需要外源性PA对比剂。为探索金纳米星肿瘤对比增强效果，经尾静脉给药后（10 mmol/L，200 μL）不同时间点进行肿瘤成像扫描。从3D MIP图和PA信号强度检测结果中可以看出，金纳米星可以提供很好的PA对比增强效果和居于较长的血液循环时间。血红蛋白是活体内天然存在的PA对比剂，因此在给药前成像组织血管可见。给药1 h肿瘤组织的PA信号强度接近最大，约为给药前的3倍，说明金纳米星具有良好的增强渗透保留（Enhanced Permeability and Retention，EPR）效应。EPR效应是因为肿瘤组织血管密度较高且血管内皮结构不完整，加上淋巴系统受损，纳米粒子在肿瘤组织长时间高浓度聚集的现象[21]。EPR效应有助于肿瘤显像，提高肿瘤诊断的灵敏性，是肿瘤靶向成像和治疗的基础。此外，由于具有光声效应的纳米材料，同时也具有光热转化效应，本研究中纳米粒子也适用于肿瘤光热治疗。虽然PA在成像灵敏性和分辨率方面具有一定的优势，但由于组织穿透深度限制，目前的PA成像研究也多选择乳腺癌作为靶向研究对象[4,22]。在本部分研究结果表明金纳米星适用于进一步肿瘤靶向成像、治疗探针的研发，这为我们未来的肿瘤靶向成像与治疗工作的进行打下良好基础。

4 结论

总之，我们证实了一种的新型的可用于PA成像的金纳米粒子对比剂。本研究中应用的合成方法简单、可重复性好。金纳米星展现出良好的生物相容性、光声转化效应，有望为肿瘤靶向PA成像及光热治疗提供新的研究方向。此外PA成像容易操作、可重复性好、成本低、高分辨率成像、高灵敏性，具有巨大的临床应用潜能。

[1] Jafari SH,Saadatpour Z,Salmaninejad A,et al.Breast cancer diagnosis: Imaging techniques and biochemical markers[J].J Cellular Phys,2018,233(7):5200-5213.

[2] Greenwood H I,Freimanis RI,Carpentier BM,et al.Clinical breast magnetic resonance imaging: technique, indications,and future applications[A].Seminars in Ultrasound, CT and MRI[C].London:WB Saunders,2018,39(1):45-59.

[3] Kim C,Favazza C,Wang LV.In vivo photoacoustic tomography of chemicals: high-resolution functional and molecular optical imaging at new depths[J].Chem Rev,2010,110(5):2756-2782.

[4] Wang LV,Hu S.Photoacoustic tomography: in vivo imaging from organelles to organs[J].Science,2012,335(6075):1458-1462.

[5] Wei Q,Song HM,Leonov AP,et al.Gyromagnetic imaging:dynamic optical contrast using gold nanostars with magnetic cores[J].J Am Chem Soci,2009,131(28):9728-9734.

[6] Khoury CG,Vo-Dinh T.Gold nanostars for surface-enhanced Raman scattering: synthesis, characterization and optimization[J].J Phys Chem C,2008,112(48):18849-18859.

[7] Zhang W,Liu J,Niu W,et al.Tip-selective growth of silver on gold nanostars for surface-enhanced raman scattering[J].ACS Appl Mater Int,2018,10(17):14850-14856.

[8] Ye Y,Chen TP,Liu Z,et al.Effect of surface scattering of electrons on ratios of optical absorption and scattering to extinction of gold nanoshell[J].Nanoscale Res Lett,2018,13(1):299.

[9] Yuan H,Khoury CG,Hwang H,et al.Gold nanostars: surfactantfree synthesis, 3D modelling, and two-photon photoluminescence imaging[J].Nanotechnology,2012,23(7):075102.

[10] Xu X,Liu R,Li L.Nanoparticles made of π-conjugated compounds targeted for chemical and biological applications[J].Chem Commun,2015,51(94):16733-16749.

[11] Elgqvist J.Nanoparticles as theranostic vehicles in experimental and clinical applications-focus on prostate and breast cancer[J].Int J Mol Sci,2017,18(5):1102.

[12] Qian C,Chen Y,Feng P,et al.Conjugated polymer nanomaterials for theranostics[J]. Acta Pharmacol Sin,2017,38(6):764.

[13] An FF,Zhang XH.Strategies for preparing albumin-based nanoparticles for multifunctional bioimaging and drug delivery[J].Theranostics,2017,7(15):3667.

[14] Chakraborty M,Jain S,Rani V.Nanotechnology: emerging tool for diagnostics and therapeutics[J].Appl Biochem Biotechnol,2011,165(5-6):1178-1187.

[15] Shi J,Votruba AR,Farokhzad OC,et al.Nanotechnology in drug delivery and tissue engineering: from discovery to applications[J].Nano lett,2010,10(9):3223-3230.

[16] Wang S,Teng Z,Huang P,et al.Reversibly extracellular pH controlled cellular uptake and photothermal therapy by pegylated mixed-charge gold nanostars[J].Small,2015,11(15):1801-1810.

[17] Joseph D,Sachar S,Kishore N,et al.Mechanistic insights into the interactions of magnetic nanoparticles with bovine serum albumin in presence of surfactants[J].Colloids Surf B Biointerfaces,2015,135:596-603.

[18] Ahadian S,Estili M,Surya VJ,et al. Facile and green production of aqueous graphene dispersions for biomedical applications[J].Nanoscale,2015,7(15):6436-6443.

[19] Hahn MA,Singh AK,Sharma P,et al.Nanoparticles as contrast agents for in-vivo bioimaging: current status and future perspectives[J].Anal Bioanal Chem,2011,399(1):3-27.

[20] Abalde-Cela S,Aldeanueva-Potel P,Mateo-Mateo C,et al.Surface-enhanced Raman scattering biomedical applications of plasmonic colloidal particles[J].J Roy Soci Inter,2010,7(S4):S435-S450.

[21] Longmire,Choyke M,Kobayashi PL.Clearance properties of nano-sized particles and molecules as imaging agents:considerations and caveats[J].Nanomedicine,2008,3(5):703-717.

[22] Wang LV.Multiscale photoacoustic microscopy and computed tomography[J].Nat Photonics,2009,3(9):503.

金纳米粒子用于小鼠乳腺癌光声成像研究

引言