涂层导尿管的体外细胞毒性试验研究
引言
导尿管是指通过尿路插入膀胱腔以排尿和冲洗膀胱为目的的管状器械。按《医疗器械分类目录》，根据涂层不同，其管理类别也不同。润滑涂层导尿管管理类别为Ⅱ类，银盐和抗菌成分等涂层导尿管管理类别为Ⅲ类。随着临床上导尿管的应用日益广泛，由导尿管引起的导尿管相关尿路感染及损伤日益得到重视，如细菌定植、抗生素耐药性、慢性感染、肾脏和膀胱损伤、肾结石、膀胱假息肉、败血症、尿道损伤等[1]。由于导尿管的原材料天然乳胶中含有对人体致敏性蛋白、生产工艺控制不严、添加剂或助剂使用比例不正确易导致生物相容性尤其是细胞毒性试验不符合要求。同时银离子被机体吸收会产生局部或全身的毒副作用，甚至造成内脏的损害[2-5]。因此建立适宜的评价体系，全面掌握市场上常用的涂层导尿管可能产生的毒性和危害是当务之急；同时为临床上导尿管的选择提供指导。
1 材料与方法
1.1 试验材料
随机抽取8家生产企业的10批次涂层导尿管，其中超滑亲水涂层的有8个，抗菌涂层的有2个。所用试剂及细胞：MEM培养基（GIBCO）；胎牛血清（GIBCO）；PBS(HYLONE)； 胰 蛋 白 酶（GIBCO）；MTT[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，SIGMA]；异丙醇（国药集团化学试剂有限公司）；DMSO（SIGMA）；L929细胞（ATCC）。
1.2 仪器与方法
本文所用仪器设备，见表1。
表1 仪器设备
设备名称 型号/规格 生产单位CO2恒温培养箱 4131 THERMO荧光倒置显微镜 TE2000-S 日本NIKON公司台式恒温振荡器 THZ-312 上海精宏实验设备有限公司电子天平 YP1002 上海佑科仪器仪表有限公司全波长扫描多功能读数仪 Various Flash THERMO离心机 SC-3610 合肥科大创新股份有限公司中佳分公司细胞计数器 Scepter2.0 MILLIPORE
1.3 试验方法
1.3.1 浸提液的制备
1.3.1.1 样品浸提液的制备
根据GB/T16886.12-2017《医疗器械生物学评价 第12部分：样品制备与参照材料》标准[6]，按0.2 g/mL的浸提比例进行浸提，设置三个浓度梯度分别为100%、50%和25%，浸提介质均为含血清培养基，浸提温度为（37±1）℃，浸提时间为（24±2）h。
1.3.1.2 分组
空白对照为含10%胎牛血清的MEM培养基，购自GIBCO，批号：1868552 ，规格：500 mL ；胎牛血清，批号：1739463，规格：500 mL。
阴性对照物为高密度聚乙烯（High Density Polyethylene，HDPE），购自河南驼人医疗器械集团有限公司。
阳性对照为10%的二甲亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO），购自Sigma，批号：RNBD8359 ，规格：100 mL。制备方法同样品浸提液的制备。
1.3.2 细胞
小鼠成纤维细胞（L929，NCTC clone 929:CCL1），购自ATCC。
1.3.3 试验方法
根据GB/T16886.5-2007《医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》[7]进行试验。冻存细胞传代生长后第1天，用0.25%胰酶将培养细胞从培养瓶中移出，细胞悬液在200 g离心3 min。用培养基重悬细胞悬液，调整密度为1×105个细胞/mL。将配制好的细胞悬液接种于96孔培养板，每孔接种100 µL。置5%CO2培养箱37℃培养24 h。第2天，弃去96孔培养板内原培养液。每孔加入100 µL含适当浓度样品浸提液、或阴性对照组、或阳性对照或溶剂（空白）的处理培养基，置CO2培养箱继续培养24 h。第3天，将培养板置显微镜下观察细胞形态。弃去孔内溶液，每孔加入50 µL质量浓度为1 g/L的MTT溶液，继续培养2 h后弃去MTT溶液，加入100 µL异丙醇溶液。震荡平板，在酶标仪570 nm和650 nm波长下测定吸光度，按下式计算存活率（%）。
式中OD570e为试样样品100%浸提液光密度平均值；OD570b为空白光密度平均值。1.3.4 结果判断
空白OD570平均值如≥0.2，则试验符合接受标准，如试验样品细胞存活率下降到＜空白的70%，则具有潜在的细胞毒性。
2 结果
按《医疗器械分类目录》，将导尿管分为两大类：超滑亲水涂层导尿管和抗菌成分涂层导尿管。超滑亲水涂层导尿管中以PVC为基材的导尿管有3个产品，均没有细胞毒性；以乳胶为基材的导尿管有5个产品，1个产品没有细胞毒性，2个25%浓度依旧有细胞毒性，1个50%浓度没有细胞毒性，1个25%浓度没有细胞毒性。2个抗菌成分涂层导尿管都是以乳胶（包括硅化乳胶）为基材，1个没有细胞毒性，1个25%浓度没有细胞毒性。超滑亲水与抗菌成分涂层导尿管细胞毒性结果，分别见表2和表3。
表2 超滑亲水涂层导尿管细胞毒性结果
序号 基材（涂层） 100%浓度 50%浓度 25%浓度1 聚氯乙烯PVC+聚乙烯吡咯烷酮PVP 无 无 无2 聚氯乙烯PVC+丙烯酸酯改性聚丁二醇 无 无 无3 聚氯乙烯PVC+聚乙烯吡咯烷酮PVP和尿素无无无4 乳胶+亲水凝胶高分子聚合物 有 有 有5 乳胶+亲水凝胶高分子聚合物 有 有 有6 乳胶+亲水凝胶高分子聚合物 无 无 无7 乳胶+亲水凝胶高分子聚合物 有 有 无8 乳胶+聚乙烯吡咯烷酮PVP 有 无 无
表3 抗菌成分涂层导尿管细胞毒性结果
序号 基材（涂层） 100%浓度 50%浓度 25%浓度1 医用硅胶+高分子亲水聚合物+银离子 有 有 无2 乳胶+水凝胶+银离子 无 无 无
3 讨论
MTT体外细胞毒性试验是通过代谢活性测定细胞的存活率。黄色水溶液MTT在活细胞内代谢性还原，生成蓝紫色不可溶的甲臜。活细胞的数目与甲臜溶于醇类后用光度计测定的色度相关。MTT体外细胞毒性试验是定量评价生物材料、医疗器械产品生物相容性常用的方法。
本研究选用国内市场上常用的超滑亲水涂层和银离子抗菌涂层导尿管，应用新版的GB/T 16886.5-2017/ISO10993.5：2009《医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验》中 MTT细胞毒性试验计算细胞毒性，计算细胞存活率。研究主要涉及聚氯乙烯（PVC）和乳胶两种基材的涂层导尿管。PVC有良好的生物相容性，均无细胞毒性，这也与以前的相关研究一致[8-9]。然而单纯的PVC和乳胶导尿管使用中都有严重的不良反应。PVC是疏水材料，容易引起病人过敏，材质较硬插管时容易使病人疼痛，容易造成导尿管相关尿路感染（占尿路感染的22%）[10]；同时软性PVC中的增塑剂邻苯二甲酸二（2-乙基乙基）酯（DEHP）有潜在的广泛的毒性[11-12]。乳胶导尿管（包括硅化乳胶）是国内市场上常用的导尿管，然而研究发现乳胶导尿管减少人类泌尿上皮细胞的DNA合成，降低细胞活力和新陈代谢能力[13]，同时它还能释放出可溶性蛋白，导致患者产生乳胶过敏反应[14]。因此为了减少传统导尿管的毒性，超滑亲水涂层导尿管和抗菌涂层导尿管应运而生，其主要是通过在普通导尿管上共价键或者非共价键结合亲水性高分子聚合物制成[15-17]。本研究涉及的亲水涂层主要是聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和一些醇类化合物，抗菌涂层主要是银盐。
研究结果发现，PVC涂层导尿管均没有细胞毒性，以乳胶为基材的超滑亲水涂层导尿管和抗菌成分涂层导尿管则结果不一。可能的原因是生产工艺控制、添加剂或助剂使用比例不同导致细胞毒性的反应不同。从试验过程来看，最主要的原因是生产工艺控制不严导致涂层导尿管在浸提的过程中涂层直接脱落（肉眼可见明显的乳白状薄膜）暴露出乳胶，产品的细胞毒性加大。对于添加剂和助剂的使用，亲水凝胶高分子聚合物由于部分产品有专利，没有明确具体的化合物，因此无法直接判断哪种化合物对细胞毒性的影响。对于抗菌成分涂层导尿管来说，银离子的含量对试验结果有着重大影响。本研究的不足之处在于，由于国内市场上新型的涂层导尿管获准上市应用的较少，有些市场上没有销售，大部分处于研发阶段，导致样本数量较少。后续将研究国内外新型涂层导尿管的细胞毒性试验分析，以及抗菌涂层的抗菌性能。
4 结论
本研究通过体外细胞毒性试验的评价方法来分析国内市场上常用的新型涂层导尿管的细胞毒性，希望为临床导尿管的选择提供指导。结果不同材质和不同涂层的导尿管对L929细胞显示出不同的细胞毒性。PVC基材的涂层导管的体外细胞毒性小，生物相容性高。乳胶基材的涂层导尿管，细胞毒性结果有差异。下一步将主要研究抗菌涂层导尿管的抗菌性能与细胞毒性的平衡关系。
[1] Feneley RC,Hopley IB,Wells PN.Urinary catheters: history,current status, adverse events and research agenda[J].J Med Eng Technol,2015,39(8):459-470.
[2] De MV,Cascione M,Toma CC,et al.Silver nanoparticles:Synthetic routes, in vitro toxicity and theranostic applications for cancer disease[J].Nanomaterials,2018,8(5):E319.
[3] 周小婷,王春仁,陈虹,等.纳米银代谢的研究进展[J].中国医疗器械信息,2015,(5):34-38.
[4] Austin CA,Umbreit TH,Brown KM,et al.Distribution of silver nanoparticles in pregnant mice and developing embryos[J].Nanotoxicology,2012,6:912-22.
[5] Ma?aczewska J.The splenocyte proliferative response and cytokine secretion in mice after 28-day oral administration of silver nanocolloid[J].Pol J Vet Sci,2014,17(1):27-35.
[6] GB/T16886.12-2017,医疗器械生物学评价 第12部分：样品制备与参照材料[S].
[7] GB/T16886.5-2017,医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验[S].
[8] 侯丽,曾冬明,王昕,等.一次性使用导尿管细胞毒性试验研究[J].中国医疗器械杂志,2012,36(3):213-214.
[9] 朱碧君,龚玮,罗丹,等.一次性使用导尿管的生物学评价体系中细胞毒性试验方法的研究[J].江西化工,2016,(6):62-65.
[10] National Nosocomial Infections Surveillance System.National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report,data summary from January 1992 through June 2004, issued October 2004[J].Am J Infect Control,2004,32(8):470-485.
[11] 王越,包世勇,沈国理,等.PVC材料导管类医疗器械DEHP析出的安全评价试验模型研究[J].中国医疗器械杂志,2018,42(3):222-224.
[12] 王越,谢昕,姜红强,等.DEHP在PVC医疗器械中的应用及安全性评价[J].中国医疗器械杂志,2018,42(4):293-295.
[13] Ruutu M,Alfthan O,Talja M,et al.Cytotoxicity of Latex Urinary Catheters[J].Br J Urol,1985,57(1):82-87.
[14] 朱碧君,周志良,余永红,等.一次性使用导尿管可溶性蛋白含量的测定[J].江西化工,2016,(6):115-119.
[15] 李育强,智倩倩,杨茂丽,等.超滑抗菌硅胶导尿管的制备与性能研究[J].生物医学工程研究,2018,37(1):101-106.
[16] 周克东,李忠泽.亲水润滑硅橡胶导尿管及其亲水润滑涂层的制备方法:中国,CN201410728083.6[P].2015-08-26.
[17] 王聘,刘俊龙,刘华龙.PVC导尿管表面亲水润滑涂层的制备及性能研究[J].中国医疗器械信息,2014,(6):51-54.
Experimental Study on Cytotoxicity of Coated Catheter in vitro