上转换发光材料应用进展及其检测系统的研究引言上转换发光（Upconversion Luminescence，UCL）是一种稀土离子吸收2个或2个以上的低能光子而辐射高能光子的发光现象，属于反斯托克斯发光[1]。在20世纪50年代末，这种在红外光激发下能发出可见光的上转换纳米材料被首次发现[2]，直到在20世纪90年代后期，随着纳米科技的兴起，人们开始将其作为一种红外光转可见光的材料应用于生物医学、环境检测和食品安全等多个领域[3-4]。 1 上转换荧光纳米材料发光机理和特点1.1 上转换发光机理2004年，Auzel[2]将上转换发光机制归结为以下4种：激发态吸收上转换、能量传递上转换、直接双光子吸收上转换和光子雪崩上转换。激发态吸收（Excited State Absorption，ESA）在1959年被提出，属于单个离子的吸收，指的是处于基态的离子通过吸收多个低能量的光子达到激发态，之后由激发态跃迁到基态，辐射出比激发光波更短、能量更高的光子。 根据传递方式的不同将能量传递（Energy Transfer，ET）分为连续能量转移、协同上转换、交叉驰豫。能量传递上转换过程是离子之间的相互作用，与激发态吸收上转换不同的是要依赖于离子浓度，为了保证能量传递的发生离子浓度必须足够的高。 直接双光子吸收指的是离子吸收光子，没有中间亚稳态直接从基态跃迁到终态，辐射出能量高的光子。 1979年，Chivian等[5]在研究LaCl3晶体中上转换发光时首次提出光子雪崩上转换，指的是在能量传递上转换过程，处于中间的亚稳态像雪崩一样急剧增加，当离子浓度达到足够高时，跃迁回基态时会辐射短波长的光子的过程。 1.2 上转换荧光纳米材料的发光特点相对于传统以有机染料和半导体量子点作为下转换发光材料，随着纳米技术的不断发展，上转换荧光纳米材料作为新一代生物荧光标记具有的显著优势主要体现在以下几个方面。 （1）化学稳定性高，不易被光漂白，易于长时间的观察。有机染料常用的如异硫氰酸荧光素FITC及花菁染料Cy3和Cy5[6]，其光学稳定性较差，易发生光漂白。由于稀土上转换材料采用稀土氟化物、硫化物、氧化物等这些材料的稳定性好，易于长时间的观察[7]。 （2）水溶性好、毒性低。随着上转换荧光纳米材料的不断引入与研究，2010年复旦大学Xiong等[8]通过实验研究表明可以将其安全地用于生物活体成像研究中。随着水溶性稀土化合物的合成解决了早期上转换荧光纳米材料存在的水溶性差、颗粒尺寸较大等相关问题[9]。 （3）采用近红外作为其激发源，解决了穿透深度低、伤害生物组织的问题[10]。采用近红外（650～1100 nm）作为激发源，与传统的可见光区域的荧光成像对比，组织的穿透深度提高了5～10 mm[11]。同时采用近红外作为激发源属于长波激发解决了紫外激发对生物组织长时间照射引起对生物组织伤害的问题[12]。 （4）发射光谱特性突出，荧光量子产生率高（3.1%），反斯托克位移较大，一般在200 nm以上[13]。较大的反斯托克位移使激发光不会干扰探测信号的接收，提高了检测灵敏度，同时窄带滤波片的易配能够节约成本。 （5）荧光寿命较长（约1 ms），是生物背景荧光寿命的105～106倍[14]。在进行时间分辨荧光显微成像测定和荧光寿命成像时，可以利用这种长寿命的荧光避免背景荧光的干扰。 （6）检测灵敏度高、具有超高选择性、解决了自发荧光干扰的问题。作为荧光标记应用于生物标本只能观察上转换荧光材料本身发光，而不具备上转换发光性能的被测生物分子不发荧光，由此消除来自内源性荧光物质和同时标记荧光染料的背景干扰，检测背景值降低，检测灵敏度提高。 2 在生物医学领域的应用随着纳米技术的发展，越来越多研究人员关注稀土上转换荧光纳米材料，下面介绍目前国内外研究者在医学领域的应用。 2.1 生物成像由于稀土上转换荧光纳米材料优越的化学性质以及低毒性使其在生命医学等方面得到广泛运用。1999年，Zijlmans等[15]首次利用氙灯提供近红外激发由大颗粒（200～400 nm）上转换荧光组成的抗体，利用抗原与抗体的特异性结合将前列腺组织切片进行标记，通过实验研究发现采用上转换荧光标记的组织比采用有机染料标记的组织更易识别其分布。2006年，Lim等[16]首次将50～150 nm的Y2O3：Yb3+/Er3+稀土上转换荧光材料用于标记线虫，但由于该荧光材料尺寸较大，导致其依旧不适用于动物活体成像。2008年，Chatterjee等[17]首次将上转换纳米粒子应用于动物更深层的组织进行成像，发现合成的PEI-NaYF4：Yb3+/Er3+纳米粒子稳定性较好，生物毒性低同时与量子点比较其荧光强度和组织穿透能力都强于量子点。Jalil等[18]研究发现二氧化硅包覆的NaYF4上转换纳米晶体表现出良好的体外和体内生物相容性，展示了其在细胞和动物成像系统中的潜在应用。2009年，复旦大学的化学与高级材料研究所的Yu等[19]提出一种独特的上转换发光成像方式，引入反向激发二向色镜和共焦针孔技术-激光扫描上转换发光显微成像，该技术具有明显的优势可以消除来自内源荧光基团以及外源性荧光的干扰，灵敏度高、选择性强、与传统的共聚焦显微镜的兼容性好。2009年，Xiong等[20]实现了小鼠全身光发光成像的小于50个纳米标记细胞的检测极限。近年来，结合传统的核磁共振成像、电脑断层扫描、荧光分子成像等多种技术获取具有分辨率高、成像快速、分子水平的多模式生物成像技术。如2017年，Chen等[21]研制了一种以上转换荧光纳米材料作为基础的胶束结合化疗、光动力治疗、荧光成像，通过实验研究表明在体外和体内都具有良好的成像能力。 2.2 生物检测上转换荧光纳米材料在生物检测目前主要应用在蛋白质检测、离子检测、阴阳离子识别、检测小分子、核酸检测、检测温度、免疫分析。其检测原理是根据上转换荧光纳米材料可以通过调节元素掺杂的浓度以及种类来调节辐射光，在具体实验中可以先制备所需的上转换荧光纳米材料作为供体，然后选择能量受体通过荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）来实现对目标物的检测。2005年，Wang等[22]最早基于FRET过程来检测亲和素浓度，在实验中将生物素连接的上转换荧光纳米材料作为供体，Au纳米粒子作为受体；Kuningas等[23]研究的一种基于FRET过程的检测17β-雌二醇，将上转换荧光材料作为供体，小分子染料作为受体；Liu等[24]研究一种利用FRET过程设计的检测谷胱甘肽（GSH）分子的方法；Wu等[25]结合磁性纳米颗粒和双光子分别与捕获的DNA和报告的DNA结合，检测肠道病毒71和柯萨奇病毒A16；随后在2013年，Liu等[26]又研究的一种将花青染料hCy7和UCNPs的荧光探针用于甲基汞的检测；Hemmer等[27]研究的一种用UCNPs和有机染料来检测亚细胞水平的温度的纳米温度计；Ju等[28]研究将单链DNA和LiYF4结合，制备DNA探针，用于定量检测目标DNA；Wu等[29]研究的一种基于上转换荧光材料与石墨烯结合的FRET的基础上的生物传感器用于检测艾滋病抗体；Rijke等[30]通过实验研究发现上转换荧光标记检测核酸的灵敏度是有机染料Cy5标记的4倍。虽然目前稀土上转换纳米材料用于生物检测的取得一些成果但与传统的有机染料以及量子点而言依旧是处于研究的初步阶段。 2.3 光动力治疗光动力效应是光动力治疗的作用基础，是一种有氧分子参与的伴随生物效应的光敏化反应，其基本要素是氧、光敏剂和可见光。近几年，上转换荧光纳米材料在光动力治疗方面被广泛运用[31]。早期，Zeng等[32]研究的利用上转换荧光纳米颗粒表面依附光敏剂AIPcS4从而达到光动力学治疗的目的；Wang等[33]研究一个应用于小鼠活体实验的上转换纳米材料基的光动力学治疗体系；Qiao等[34]将三官能核壳结构上转换发光纳米粒子与光敏剂共价接用于荧光成像、磁共振成像和光动力学治疗。最近，Liu等[35]研究的基于上转换纳米粒子的热胶束双模成像和光动力治疗肝癌，该研究中使用一种抗肿瘤药物和光敏剂mitoxantrone（MX）将其与抗EpCAM抗体接枝的上转换纳米胶束，用于双模式磁共振/上转换发光（Mr/UCL）引导的协同化疗和光动力疗法通过实验研究证实该胶束具有良好的生物相容性，具有专一性和优良的荧光与磁性。 2.4 药物运输与释放药物运输通过上转换发光与装载药物的光响物质，形成近红外激发的药物释放。Zhang等[36]研究出一种具有磁性和上转换性质的介孔型稀土上转换荧光纳米材料，通过实验研究表明该材料可用于药物的传输；Xing等[37]用硅涂层上转换纳米粒子自组装光反应共聚物制备了一种纳米复合材料，实现了近红外光控制药物释放和癌症治疗。 目前国内外对于上转换荧光纳米材料在生物医学领域的应用依旧拥有极大的潜力，发展前景巨大，研究的趋势朝着诊疗一体化、联合治疗方向发展。 3 上转换发光检测系统的研究随着纳米技术的迅速发展以及上转换荧光纳米材料的独特优势，吸引了国内外开始对上转换发光检测系统的研制。 早期，Zijlmans等[15]首次利用氙灯提供近红外激发上转换荧光粉粒子，采用改进型的荧光显微镜，通过将配有75 W氙灯的Leica DMR-LB直立型荧光显微镜移除KG系列的“热镜”和BG-38的“红阻”但令其团队发愁的是后期需要昂贵的仪器来检测化学反应产生的短暂的光。 2006年，Lim等[16]采用20×，0.4 NA物镜（Nikon，Melville，NY）和一种强度耦合CCD相机的倒置显微镜对线虫的上转换发光进行了红外激发成像，最后用光纤耦合CCD光谱仪（海洋光学，Dunedin，FL）采集上转换发光光谱。 2008年，Chatterjee等[17]采用980 nm的VA-Ⅱ型全固态态半导体激光器作为激发源（1.0 A)在暗室中观察到发光，并用带有热滤光片的CCD数码相机进行记录，以消除近红外散射。次年Salthouse等[38]研发第一个小型动物上转换成像仪用于上转换纳米粒子体内成像，该仪器用980 nm激光二极管（300 mW）作为激发光，激光被准直、过滤和扩散，图像由摄像机拍摄，通过镜头组件进行聚焦，然后用激光滤光片进行滤波。 2009年，Lia等[39]搭建一个由具有平行板的小动物成像室、激光器、具有聚焦光学器件的Galvo控制光学扫描器、成像远心透镜和摄像机组成的系统。将来自激光二极管的光通过适当的带通滤波器滤波，随后聚焦到成像室的一个板的特定斑点上。发射的荧光信号用长通或短程滤波器（分别为Cy5.5或unp）与适当的带通滤波器相结合进行滤波最后采用高灵敏度的CCD摄像机采集图像。经过实验研究表明将上转换荧光纳米颗粒用于生物活体成像并未受到来自自发荧光的干扰。 2010年，Xiong等[8]采用改良的Olympus FV1000激光扫描上转换发光显微镜5对细胞进行共聚焦成像，该显微镜配有连续波激光器，波长为980 nm，采用60×浸油物镜。经过实验研究用β-NaLuF(4)：Gd(3+)，Yb(3+)，Tm(3+)纳米晶体作为发光，实现了小鼠全身光发光成像的＜50个纳米标记细胞的检测极限。2009年，复旦大学化学系与复旦大学妇产科医院[20]搭建一个上转换纳米颗粒用于小动物活体成像的系统，在980 nm处发射的连续波激光由电流计反射镜定向，然后由物镜（60×浸油物镜）进入标本。从扫描点的位置发射的光被电流计反射镜偏转，然后通过反向激发二向色镜与激发分离，然后通过共焦针孔，并最终进入光电倍增管（PMT，R6357增强型）作为探测器。通过实验研究表明上转换发光成像技术适用于跟踪和标记复杂生物系统的组件。 近期,芬兰的Labrox和Hidex公司研究一种上转换荧光探针专用的数字化显示读出设备[40]；国内针对上转换实际应用的检测设备研发方向主要以免疫分析仪为主[41]。如中国科学院上海光学精密机械研究所和解放军军事医学科学院研究的上转换发光技术生物传感器、上转换发光免疫试纸扫描检测系统[42-43]；中国解放军白求恩医务学校检验医学教研室研究的基于面阵CCD的便携式上转换发光免疫层析检测系统[44]。目前市面缺乏商业的专门检测上转换荧光纳米这种材料的设备，对于如何进一步的开展建立专用针对检测设备对上转换荧光纳米材料的实际应用具有深远的意义。 4 结语由于上转换荧光纳米材料的显著优势，使其在生物医学领域有着广泛的运用。然而，目前还未有现成的商业荧光成像系统，多数情况仍采用传统的荧光检测设备进行检测实验。然而，传统检测设备在检测过程中由于设备的信噪比较低使其难以准确的检测，而且传统的红外激发器体积较大使其检测系统较为笨重。随着科技不断的发展，政府对医疗设备的不断关注与投入以及医疗市场的需求，未来检测系统会朝着便携化、一体化、智能化和全自动化发展。 （1）便携化。传统的红外激发器为了确保稳定性整个设计结构较为笨重，可以考虑研发稳定性好而且小巧的红外激发光源，或者可以考虑采用无线远程对激光器的智能控制。 （2）一体化。随着医疗技术不断的创新与发展，在今后可以考虑将多种治疗方式集合在一个平台上，集合各个治疗方式的优势，提高检测准确性。 （3）智能化。随着智能设备的不断普及以及互联大数据时代的到来，今后可以通过互联网实现数据的共享，实时记录分析检测的结果，为建立健康服务平台提供数据。 （4）全自动化。机器设备和系统在没有人或较少人的直接参与下，按照人的要求，经过自动检测、信息处理、分析判断、操纵控制，实现预期的目标。 [1] Haase M,Schäfer H.Upconverting nanoparticles[J].Angew Chem Int Ed Engl,2011,50(26):5808-5829. [2] Auzel F.Upconversion and anti-stokes processes with F and D ions in solids[J].Cheminform,2004,104(1):139-73. [3] David J,Stephens’,Victoria J,等.活细胞成像中的光学显微技术[J].中山大学研究生学刊(自然科学.医学版),2008,(3):91-102. [4] Corstjens PLAM,Dood CJD,Schip PV,et al.Lateral flow assay for simultaneous detection of cellular-and humoral immune responses[J].Clin Biochem,2011,44(14-15):1241-1246. [5] Chivian JS,Case WE,Eden DD.The photon avalanche: A new phenomenon in Pr3+-based infrared quantum counters[J].Appl Phys Lett,1979,35(2):124. [6] De Silva AP,Gunaratne HQN,Gunnlaugsson T,et al.Signaling recognition events with fluorescent sensors and switches[J].Chem Rev,1997,97(5):1515-1566. [7] Etchart I,Bérard M,Laroche M,et al.Efficient white light emission by upconversion in Yb3+-, Er3+- and Tm3+-doped Y2BaZnO5[J].Chem Commu,2011,47(22):6263. [8] Xiong L,Yang T,Yang Y,et al.Long-term in vivo biodistribution imaging and toxicity of polyacrylic acid-coated upconversion nanophosphors[J].Biomaterials,2010,31(27):7078-7085. [9] 杨会然.罗丹明类近红外荧光染料的设计、合成及其生物成像应用研究[D].南京:南京邮电大学,2016. [10] Weissleder R.A clearer vision for in vivo imaging[J].Nat Biotechnol,2001,19(4):316-317. [11] Frangioni JV.In vivo near-infrared fluorescence imaging[J].Curr Opin Chem Biol,2003,7(5):626-634. [12] Chen G,Somesfalean G,Liu Y,et al.Upconversion mechanism for two-color emission in rare-earth-ion-doped ZrO2 nanocrystals[J].Phys Rev B,2007,75(19). [13] 吴伯岳,严秀平.稀土发光材料在荧光成像中的应用[J].生物物理学报,2011,27(4):289-300. [14] Reifernberger JG,Ge P,Selvin PR.Progress in lanthanides as luminescent probes[J].Fluorescence,2005,15:529-524. [15] Zijlmans H,Bonnet J,Burton J,et al.Detection of cell and tissue surface antigens using up-converting phosphors: A new reporter technology[J].Anal Biochem,1999,267(1):30-36. [16] Lim SF,Riehn R,Ryu WS,et al.In vivo and scanning electron microscopy imaging of up-converting nanophosphors in Caenorhabditis elegans[J].Nano Lett,2006,6(2):169-174. [17] Chatterjee DK,Rufaihah AJ,Zhang Y.Upconversion fluorescence imaging of cells and small animals using lanthanide doped nanocrystals[J].Biomaterials,2008,29(7):937-943. [18] Jalil RA,Zhang Y.Biocompatibility of silica coated NaYF4 upconversion fluorescent nanocrystals[J].Biomaterials,2008,29(30):4122-4128. [19] Yu MX,Li FY,Chen ZG.Laser scanning up-conversion luminescence microscopy for imaging cells labeled with rare-earth nanophosphors[J].Anal Chem,2009,81(3):930-935. [20] Xiong L,Chen Z,Tian Q,et al.High contrast upconversion luminescence targeted imaging in vivo using peptide-labeled nanophosphors[J].Anal Chem,2009,81(21):8687-8694. [21] Chen G,Jaskula SR,Esquibel CR,et al.Neuroendocrine tumor-targeted upconversion nanoparticle-based micelles for simultaneous NIR-controlled combination chemotherapy and photodynamic therapy, and fluorescence imaging[J].Adv Funct Mater,2017,27(8):1604671. [22] Wang L,Yan R,Huo Z,et al.Fluorescence resonant energy transfer biosensor based on upconversion-luminescent nanoparticles[J].Angew ChemInt Ed,2005,44(37):6054-6057. [23] Kuningas K,Ukonaho T,Päkkilä H,et al.Upconversion fluorescence resonance energy transfer in a homogeneous immunoassay for estradiol[J].Anal Chem,2006,78(13):4690-4696. [24] Liu J,Liu Y,Liu Q,et al.Iridium(III) complex-coated nanosystem for ratiometric upconversion luminescence bioimaging of cyanide anions[J].J Am Chem soc,2011,133(39):15276-15279. [25] Wu S,Duan N,Ma X,et al.Simultaneous detection of enterovirus 71 and coxsackievirus A16 using dual-colour upconversion luminescent nanoparticles as labels[J].Chem Commu,2012,48(40):4866. [26] Liu Y,Chen M,Cao T,et al.A cyanine-modified nanosystem for in vivo upconversion luminescence bioimaging of methylmercury[J].J Am Chem soc,2013,135(26):9869-9876. [27] Hemmer E,Quintanilla M,et al.Temperature-induced energy transfer in dye-conjugated upconverting nanoparticles: A new candidate for nanothermometry[J].Chem Mater,2015,27(1):235-244. [28] Ju Q,Uddayasankar U,Krull U.Paper-based DNA detection using lanthanide-doped LiYF4 upconversion nanocrystals as bioprobe[J].small,2014,10(19):3912-3917. [29] Wu YM,Cen Y,Huang LJ,et al.Upconversion fluorescence resonance energy transfer biosensor for sensitive detection of human immunodeficiency virus antibodies in human serum[J].Chem Commu,2014,50(36):4759. [30] Rijke FVD,Zijlmans H,Li S,et al.Up-converting phosphor reporters for nucleic acid microarrays[J].Nat Biotechnol,2001,19(3):273-276. [31] Liu L,Zhang H,Song D,et al.Upconversion nanoparticle-based fluorescence resonance energy transfer system for effective sensing caspase-3 activity[J].Analyst,2018,143(3):761-767. [32] Zeng L,Xiang L,Ren W,et al.Multifunctional photosensitizerconjugated core-shell Fe3O4@NaYF4:Yb/Er nanocomplexes and their applications in T2-weighted magnetic resonance/upconversion luminescence imaging and photodynamic therapy of cancer cells[J].RsC Adv,2013,3(33):13915. [33] Wang C,Tao H,Cheng L,et al.Near-infrared light induced in vivo photodynamic therapy of cancer based on upconversion nanoparticles[J].Biomaterials,2011,32(26):145-154. [34] Qiao XF,Zhou JC,Xiao JW,et al.Triple-functional core-shell structured upconversion luminescent nanoparticles covalently grafted with photosensitizer for luminescent, magnetic resonance imaging and photodynamic therapy in vitro[J].Nanoscale,2012,4(15):4611. [35] Liu K,Liu X,Zeng Q,et al.Covalently Assembled NIR nanoplatform for simultaneous fluorescence imaging and photodynamic therapy of cancer cells[J].ACs Nano,2012,6(5):4054-4062. [36] Zhang F,Braun GB,Pallaoro A,et al.Mesoporous multifunctional upconversion luminescent and magnetic “nanorattle” materials for targeted chemotherapy[J].Nano Lett,2012,12(1):61-67. [37] Xing Q,Li N,Jiao Y,et al.Near-infrared light-controlled drug release and cancer therapy with polymer-caged upconversion nanoparticles[J].RsC Adv,2015,5(7):5269-5276. [38] Salthouse C,Hildebrand S,Weissleder R,et al.Design and demonstration of a small-animal up-conversion imager[J].Opt Express,2009,16(26):21731-21737. [39] Lia C,Mitchella GS,Duttab J,et al.A High sensitivity multispectral three-dimensional fluorescence optical tomography system for small animal imaging[A].Proceedings of SPIE-The International Society for Optical Engineering[C].2009,7174:28. [40] Sedlmeier A,Hlavá ek,Antonín,Birner L,et al.Highly sensitive laser scanning of photon-upconverting nanoparticles on a macroscopic scale[J].Anal Chem,2016,5b04147. [41] 吴悦.基于上转换材料的激光诱导荧光检测系统[D].合肥:合肥工业大学,2016. [42] 卢健,周蕾,赵永凯,等.上转换发光免疫试纸条扫描检测系统研究[J].光子学报,2006,35(4):555-560. [43] 刘超,王晓荣,许新岳,等.免疫层析试纸条上转换发光检测系统的研究与开发[J].电子器件,2017,40(6):1588-1592. [44] 李抄,杨子健,杜耀华,等.基于面阵CCD的便携式上转换发光免疫层析检测系统[J].军事医学,2017,41(11):906-911. Application Progress of Upconversion Luminous Material and Its Detection System |