近代显微成像技术的研究进展与应用

引言

显微成像技术是一种借助物理方法观察微小物体的技术手段，它的发展与物理学领域对光的认识密不可分。1837年，德国科学家Abbe[1]揭示了远场光学显微镜在光的衍射效应和有限孔径分辨率的制约下能够获得的最小分辨率不超过200 nm，这一衍射极限使传统的光学显微镜无法对微小物体进行更精微的观察。在近代生命科学领域，尤其是神经生物学和遗传发育等学科，备受关注的生理活动更多发生在几个到几百纳米水平，很多亚细胞器、细胞结构、生物大分子以及细胞膜内部的生理活动很难被传统的光学显微镜捕捉到。尽管改变光源可以大幅提升分辨率，但由此发展出的电子显微成像技术只适于观察已被固定的物体，无法实时观察活的生命现象。为了在生命领域得到更真实的观察，借助计算机技术联用光电技术的飞速发展，激光扫描共聚焦显微镜以及各种超分辨显微成像技术逐渐被开发，这些技术不仅在分辨率上实现了对衍射极限的突破，更在多维度上实现了对生命现象的实时动态捕捉，成为分子细胞生物学领域，尤其是神经生物学、遗传学、生态学和生理学等学科的重要观察手段[2-4]。

本文主要介绍显微成像技术中的荧光成像、共聚焦显微成像和超分辨显微成像技术；在超分辨显微成像技术部分，主要介绍受激发射损耗（Stimulated Emission Depletion，STED）技术。

1 光学显微成像

1.1 常用显微技术

显微镜根据成像方式可以分为光学显微镜、共聚焦显微镜和体视显微镜[5]，其中体视显微镜因为在观察过程中可使用器械微操作又被称作解剖镜，在实验室中常被用于样品的前处理，例如植物组织（花蕊、花药）的剖出等。光学显微镜和共聚焦显微镜广泛应用于近代生命科学领域，观察并记录各种生命现象，由此发展出一系列有学科针对性的显微成像技术：借助结构光和图像的重构算法得到超高分辨图像的结构光照明显微技术（Structured Illumination Microscopy，SIM）可以开展活细胞的超高分辨观察[6-7]；使用荧光共振能量转移技术和生物发光共振能量转移技术可以动态的检测蛋白质相互作用[8]；使用多光子显微成像技术可获得厚样本的三维成像，例如捕捉脑组织深层神经元及轴突的空间分布[9]。

基于光学显微镜的常用显微成像技术有：明场成像、暗场成像、偏光成像、荧光成像、相衬成像、微分干涉成像和调制对比成像等。基于共聚焦显微镜的常用显微技术有：荧光成像、全内反射成像、超分辨显微成像和多光子显微成像等。明场成像、暗场成像、偏光成像和荧光成像主要反映形貌信息，而相衬成像、微分干涉成像和调制对比成像主要反映标本结构中的相位变化[4]。全内反射成像主要用于观察位于或接近细胞质膜的变化[10]；多光子显微成像在深度观察方面优于单光子；而超分辨显微成像在分辨率要求比较高的实验中更有优势[11-12]。在所有技术中，荧光成像是最常用的成像技术。

1.2 荧光成像

荧光成像是一种落射光照明的成像技术，光源通常为汞灯或发光二极管，荧光光源通过落射照明光路由分光棱镜入射到物镜，然后由滤光片滤出一定波长的激发光激发样品产生荧光，荧光再经截止滤光片阻挡，只滤出一定波段的荧光返回物镜通过镜筒透镜成像。由于激发光和被激发荧光之间有波长差，使得截止滤光片可以选出被激发荧光，同时截止激发光[4]。

使用荧光成像技术的样品需要满足一个基本条件，即样品待观察部位能被一定波长的光激发出荧光。常规做法是选择合适的荧光染色剂（染料）对样品待观察的部位进行荧光标记，使用单一染料或联合多种染料标记出待观察部位。如果样品本身存在自发荧光，需要在选择荧光染料时多加考虑，尽可能避开不想观察区域自发荧光的干扰。在染料的选择和使用中，尤其是进行多重标记时，要尽量避免染料之间串色，使用不同种属来源的抗体进行染色时优先选择稳定性和抗淬灭性强的染料。目前市场上有很多技术成熟的染料公司可供选择，比如Sigma公司。各大仪器公司的主页也会有相应的染料光谱数据以供参考。在做特殊要求的实验时，比如超高分辨观察，使用技术研发团队自行开发的染料将获得更高的成像效果和分辨率。

2 共聚焦显微成像

2.1 单光子（共焦）显微成像

单光子（共焦）显微成像技术中，所谓单光子就是用一个光子激发一个荧光分子，激发光波长一般短于发射光波长，而多光子是用两个或多个光子激发一个荧光分子，激发光波长要长于发射光波长。在日常工作中，共聚焦显微成像系统最常配备的激光器是单光子激光器，最常用的荧光激发方式是单个光子激发，因此我们通常所说的共聚焦显微成像就是单光子（共焦）显微成像。多光子激光器可以独立配置于一台共聚焦显微系统上，也可以和单光子激光器共同配置于共聚焦上，使用时由常用的单光子模式切换到多光子模式， 即可开展多光子（共焦）显微成像观察。单光子（共焦）显微成像技术与多光子（共焦）显微成像技术的主要区别在于使用的激光器不同，成像系统和图像采集系统都基于共聚焦显微成像系统，因此这两个成像技术都属于共聚焦显微成像技术体系，具有共聚焦显微成像系统的优势。

对于光学显微镜来说，深度成像和提高分辨率很难同时实现，尤其在高倍率下这一矛盾更为突出，共聚焦显微成像系统的点光源优势和对非焦平面散射光的屏蔽作用可以很好的解决这一问题。共聚焦显微成像系统的光源是激光，相比光学显微成像系统的普通光源它的单色性和相干性更好，激光光束沿光路以点对点的扫描方式逐一聚焦于样品焦平面某点，激发样品发射荧光，发射光经检测针孔被光电倍增管所采集，最后由计算机转化形成荧光图像[5,12]。这种点对点的扫描方式和针孔对非焦平面以及焦平面上的非焦点光斑信息的阻隔，能有效提高图像在各深度下的分辨率和清晰度。共聚焦扫描系统沿z轴上下移动形成的一系列共焦平面，经软件整合为三维图像，还能更加立体直观的呈现样品深层信息，例如特殊合成的小分子或具有靶向性/特异性的物质进入细胞，通过三维重构可以直观的看到材料在亚细胞器不同焦平面和部位的分布，判断材料是否进入或仅表覆于亚细胞器。

荧光强度与特异性荧光标记蛋白的表达量成正相关，可以通过分析样品的荧光强度实现定量分析（图1）。使用多位点长时间序列扫描，可以动态记录活细胞生理过程，例如药物对亚细胞器的靶向实验中，药物分子进入细胞的变化曲线、药物分子与亚细胞器的空间分布以及细胞活性状态的变化可以在一次观察中获得。多位点采集可以在统计学意义上提高数据的可靠性。对于比较大的样本，例如植物组织或小鼠脑片，使用自动拼接功能结合z轴层扫，可以得到整个样本的立体信息，获得更丰富的有效信息。

2.2 多光子（共焦）显微成像

在脑神经科学和植物学等领域，对样本实现深度观察是一个最基本的实验要求[13]。常用的光学显微镜和共聚焦显微镜受限于光源很难实现深度超过100 µm的观察，多光子显微成像技术采用长波激发光（穿透深度比单光子激光器深）[14]，以脉冲激光的方式使两个或多个光子同时到达被激发的电子，穿透深度可达1 mm，因此在实现组织深层次成像方面有很大的优势。结合样品的透明化处理，多光子显微成像可以得到很好的成像效果，例如上海交通大学李小卫等[12]研究的透明脑块三维重构图（图2）可以提供样本深处神经元和轴突的分布及走向，进行直接分析。

在实际的工作中，多光子显微成像系统观察的样品一般都比较大、厚或是动物等个体级别，正置的显微成像系统相对于倒置的显微成像系统会更有优势一些，尤其在开展小动物活体实验时，麻醉小鼠安放在正置显微成像系统下更便捷，小鼠脑部的开放创口也更易于被固定，保持实验过程中被激光照射后稳定不动。此外，在材料科学部分领域，尤其是合成药物分子等研究方向，材料自身的激发光谱较宽，材料对长、短波长的需求各异。检测平台或实验室内常配的单光子激光器波长范围一般在405～775 nm，材料很难得到充分激发。常配的多光子激光器波长范围一般在680～1080 nm并且连续可调，可以很好的满足长波长激发光的需求。根据双光子的激发原理，被激发的荧光分子同时吸收两个长波长的光子后发射出一个波长较短的光子，这个效果与使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的，也就是说采用两倍单光子激发波长也可达到激发条件，这就可以很好的满足需要波长较短的材料。在观察时对两倍单光子激发波长左右一段范围内逐一激发再确认，或者在这段范围内进行光谱扫描，可以找到最优的激发波长。基本上这类宽范围激发光谱的材料都能使用多光子获得较好的实验结果，因此多光子显微成像也逐渐被越来越多的材料科学所关注并使用。活体动物双光子显微成像，见图3。

3 超分辨显微成像

光学衍射极限的概念基于光的波动本性，远场光学显微镜受限于光学衍射极限，分辨率仅能达到可见光波长的一半左右（约200 nm），而对于生命科学领域所关注的生理活动，往往需要分辨率达到几十纳米甚至更微小。为了提高分辨率，早期的研究主要集中在对光源和光学物理元件的探索，例如减小光的波长（典型代表是电子显微镜）、使用共焦小孔减小艾里斑尺寸（典型代表是共聚焦显微镜）、设计更为复杂的光学收集系统增加有效孔径角（典型代表是4Pi显微镜）等。近代对于光学显微技术的探索，主要借助于光与物质相互作用中产生的各种效应[15]。2014年美国Eric Betzig/William E. Moerner的光激活定位显微技术（Photoactivated Localization Microscopy，PALM）及异曲同工的德国Stefan W. Hell的STED技术同获诺贝尔奖，突破了光学显微成像的衍射极限并革新了超分辨显微成像术的历史[16]。

目前超分辨显微成像技术主要分为两类[17-23]：一类是基于调制照明光斑以缩小系统的点扩散函数的超分辨技术：其代表是STED技术以及在STED技术基础上进一步延展的可逆饱和光荧光转移显微技术和基态损耗技术；另一类是基于单分子定位的超分辨显微成像技术：主要代表是PALM技术、随机光学重建显微技术、以及荧光活化定位显微技术。除了这两类主流的超分辨显微成像技术，还有一类重要的活细胞超分辨显微成像技术，它是基于结构照明原理的SIM技术。

目前，这些超分辨显微成像技术已由各大显微镜品牌公司应用于各自的产品中，而STED技术的发明人Stefan Hell教授团队自创显微镜品牌公司Abberior Instruments，独立开发并不断拓展、更新这一技术在实际工作中的应用。关于STED技术，我们可以理解为两束具有同轴光路的激光共同作用于一个位点，一束用于激发荧光物质得到荧光（圆斑状），另一束环状激光使圆斑外周部分区域受激发射（圆环状），中心无重合的荧光区域被采集，两束激光重合的受激发射区域被滤光片阻挡，从而获得尺寸更小的光斑。这个技术通过控制环状激光的大小提升分辨率，当无重合区域足够小时，分辨率能得到极大的提高。配合白激光的使用，xy平面分辨率可以达到50 nm以下，z轴分辨率130 nm以下，比共聚焦的分辨率有显著提升，能够获得更多有效科学信息（图4）[24-25]。

Abberior团队近年在STED技术基础上继续开发的超分辨显微成像系统在分辨率上有进一步提高，XY平面分辨率可以达到20 nm以下，Z轴分辨率30～45 nm以下，3D分辨率可达到70 nm×70 nm×70 nm，稍有遗憾的是这一技术暂时无法开展时间序列扫描。

4 总结

显微成像技术随着学科交叉的日益密集在不断发展，一系列具有学科针对性的特色技术逐渐被开发并使用。操作系统的设计更加便捷，使更多不同学科背景的科研工作者能够快速掌握并开展工作。图像的采集和分析更贴近学科和研究方向，使检测数据结果不仅简明直观，而且具有统计学意义。技术层面更加深入解决科研需求，使观察得以更微小、采集得以更快速、探索得以更深层、捕捉得以更稳定持久。多学科背景研发团队的融合，从染料研发到显微成像系统的开发，从后续算法解析到平台控制软件，包括系统对环境的适应性，都在进一步被关注并完善，21世纪的显微成像技术必将为各学科的发展做出更大的贡献。

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