Article Info

山东省医疗器械产品质量检验中心/山东省医疗器械生物学评价重点实验室，山东济南 250101

[摘要]目的通过比较两组胶原蛋白止血海绵和普通纱布在猪的肝脏创伤模型中的止血时间、出血量和局部组织反应，为可吸收止血材料在动物试验中的评价提供有效出血创伤模型，同时为胶原蛋白止血海绵的临床应用提供参考依据。方法将18头实验用小型猪（雌性未孕，体重30～40 kg）随机分为A、B、C三组（A组为胶原蛋白海绵组，B组为医用胶原蛋白海绵组，C组为普通纱布组），每头猪建立肝脏出血模型，定量检测胶原蛋白止血海绵和普通纱布的止血时间和出血量，并在8周后，解剖动物观察创面血性荚膜形成情况，取创伤部位肝脏组织进行HE染色，进行病理组织学观察炎症反应情况和创口愈合情况等。结果A、B、C三组止血时间分别为（215.00±69.50）、（205.00±48.06）和（480.00±90.99）s，出血量分别为（3.08±1.65）、（2.71±1.34）和（15.77±3.58）g，A、B两组和C组比较止血时间和出血量均有显著性统计学差异（P＜0.05）。病理观察结果表明所有动物肝脏创面无感染性炎症反应，未见血性荚膜，损伤创口愈合良好。结论猪的肝脏出血模型能有效评价止血材料的有效性，在本模型中胶原蛋白止血海绵和普通纱布相比有明显的止血作用。

引言

胶原蛋白主要分布于皮肤、肌腱等组织，经过病毒灭活、去脂、酶切等工艺制备而成。由于去除了能够引起免疫原性的端肽，具有低免疫原性和可降解性。胶原蛋白止血海绵状结构具有良好的渗水和吸水能力，局部止血时能很好的吸收出血，同时加强血小板的粘附和聚集，并启动内源性的止血途径，从而达到止血效果[1-2]。目前胶原蛋白已被广泛应用于制备医疗材料，其生物安全性等优点已被广泛认可，但是作为可降解的止血材料，其止血有效性在大动物出血模型中，需要继续研究。将两组不同的胶原蛋白海绵及普通纱布用于猪的肝脏出血模型中进行比较研究，来进一步确认胶原蛋白作为止血材料的优势。

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器

呼吸麻醉机（型号WATO EX-20，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司），兽用便携式多参数监护仪（型号iMEC8 Vet，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司），压力传感系统（LCKD-1kg型压力表，DP25B-S-230型压力传感器，OMEGA），分析天平（型号JA2003N，200 g，上海精密科学仪器有限公司），正置显微镜（型号BX53/DP73，日本Olympus），TissUE-Tek自动组织染色封片工作站（型号Tissue-Tek Prisma 6133-Glas g2，日本樱花精机会社），HM355S全自动切片机（型号HM355S，美国赛默飞世尔），组织脱水机（型号Excelsior AS，美国Thermo），自动组织包埋机（型号Histostar，美国Thermo）。A组胶原蛋白海绵（4.5 cm×4.5 cm×0.5 cm，广州创尔生物技术股份有限公司），B组医用胶原蛋白海绵（100 mm×50 mm×5 mm，上海其胜生物制剂有限公司），无菌纱布（6 cm×8 cm，8层A型）。

1.2 实验动物及分组

普通级实验用小型猪18头[天津市百农实验动物繁育科技有限公司，许可证号：SCXK（津）2015-0002]，雌性未孕，体重30～40 kg，随机分为A、B、C三组：A组为胶原蛋白海绵组；B组为医用胶原蛋白海绵组；C组为普通纱布组。每组6头。本研究获得山东省医疗器械产品质量检验中心动物伦理委员会批准，实验过程中动物的处理符合伦理要求。

1.3 实验方法

动物术前24 h禁饲不禁水。按0.5 mL/kg的剂量，通过耳静脉一次性注射丙泊酚注射液进行诱导麻醉。诱导麻醉后，进行气管插管，连接呼吸麻醉机，使用异氟烷进行气体维持麻醉。动物仰卧位，于肝脏相应皮肤部位剃毛，备皮区约15 cm×20 cm，清洁后用碘伏进行彻底消毒，铺上盖单、洞巾等，暴露切口部位。确认动物麻醉（肌肉松弛）后，于暴露切口部位做约4 cm切口，钝性分离腹外斜肌和内斜肌，剪开腹膜，暴露肝脏。将肝脏用手术刀划出长2 cm，深3 mm的伤口（伤口部位在距肝脏边缘3 cm处）。

A组于10 s内将一片胶原蛋白海绵完全覆盖在伤口上，并覆盖无菌纱布块，使用压力传感系统进行按压，按压力度为（10±2）N。每30 s观察一次止血情况（仅拿开无菌纱布块观察止血情况），如未能止血，继续覆盖另一块无菌纱布块按压，直至止血（连续观察10 min，仍不能有效止血则视为不能止血）。止血后记录止血时间及出血量。B组同法操作；C组仅使用无菌纱布同法操作。

1.4 主要观察指标

观察并记录止血时间，以时间单位（s）记录止血时间。使用秒表读数方式观察并记录止血时间。

观察并记录出血量[3]，以重量单位（g）记录出血量。先将无菌纱布称重，止血完成后，将带有血液的无菌纱布再次称重。止血后无菌纱布的重量减去止血前无菌纱布的重量即为出血量。

术后8周，采用安乐死的方法处死所有动物，进行病理学检查，观察创面血性荚膜形成情况，取肝脏创面用10%中性福尔马林固定，HE染色，观察炎症反应情况和创口愈合情况等。

1.5 统计学分析

使用SPSS 17.0对止血时间、出血量（表示为x-±s）进行统计学分析，当P＜0.05时表示有显著性统计学差异。

2 结果

2.1 止血时间和出血量

A组和C组止血时间和出血量均有显著性统计学差异（P＜0.05），结果见表1。B组和C组止血时间和出血量均有显著性统计学差异（P＜0.05），结果见表2。

表1 A组和C组肝脏止血时间和出血量结果

注：*表示有显著性统计学差异（P＜0.05）。

表2 B组和C组肝脏止血时间和出血量结果

注：*表示有显著性统计学差异（P＜0.05）。

2.2 病理学检查

取肝脏创面用10%的中性福尔马林固定液固定，将固定后的组织经石蜡包埋后切片，采用常规苏木素—伊红染色法进行染色，在光学显微镜下观察各组动物肝脏的创口周边组织学反应情况，结果如下。

A组创口处可见结缔组织增生，可见少量增生的胶原纤维及成纤维细胞，可见少量含铁血黄素沉着，未见感染性炎症反应，见图1。

B组创口处纤维结缔组织增生，被膜增厚，可见少量增生的胶原纤维及成纤维细胞，创口处可见少量含铁血黄素沉着，未见感染性炎症反应，见图2。

C组可见结缔组织增生，可见少量含铁血黄素沉着，未见感染性炎症反应，见图3。

图1 A组创口处染色结果

注：a. 100×；b. 400×。

图2 B组创口处染色结果

注：a. 100×；b. 400×。

图3 C组创口处染色结果

注：a. 100×；b. 400×。

病理学检查结果显示，A、B、C三组肝脏创面均未见血性荚膜形成，肝脏创口未出现感染性炎症反应，肝脏创口愈合良好。

3 讨论

本次研究选择猪的肝脏损伤出血模型符合研究预期要求，肝脏属于实质性器官，结构复杂，功能繁多，有较大的动、静脉，也有丰富的毛细血管，具有丰富的血流[4]。未选择小动物肝脏出血模型进行研究，主要考虑小动物血容量小，出血时间和出血量相对偏小，模型具有局限性。

止血是血管、血小板及凝血因子的共同作用来完成[5]。其中，血小板在初期止血过程中起着重要的作用。止血过程中除了局部的加压和止血材料的促凝作用外，还与止血材料的结构有重要关系[6]。常规临床手术中，大血管可以结扎阻断，但不能解决毛细血管的止血问题[7]。通过本次研究可知，以胶原蛋白为材料的止血海绵能够较快速的解决实质性脏器的出血问题，明显优于普通纱布，为临床手术节省大量时间。

临床常用的可吸收止血材料有氧化纤维素、凝血酶制剂、胶原蛋白海绵、微孔多聚糖类止血粉、壳聚糖等[8]。众多止血材料中，胶原蛋白有很好的生物学性能，具有可降解、低抗原、生物相容性良好等优点[9-16]。胶原蛋白独特的三维网状多孔结构能够吸附大量的组织液，能更有效地达到止血目的。此次研究结果表明以胶原蛋白为材料的止血海绵的止血有效性较普通纱布好，有明显的止血作用，并且对创伤的副作用较小，符合临床预期使用要求。

[1] Raccuia JS,simonian C,Dardik M,et al.Comparative efficacy of topical hemostatic agents in a rat kidney model[J].Am J Surg,1992,163(2):234-238.

[2] Wagner WR,Pachence JM,Ristich J,et al.Comparative in vitro analysis of topical hemostatic agents[J].J Surg Res,1996,66(2):100-108.

[3] 徐桢琦,陈规划,徐美兰,等.纤维蛋白粘合胶动物实验研究[J].中华实验外科杂志,1997,14(3):185-186.

[4] 童颖丹.新型肝脏止血捆扎带的研制及应用研究[D].长沙:中南大学,2011.

[5] 刘宿,牛金柱,葛衡江,等.三种止血材料对兔肝脏创伤止血效果的观察[J].创伤外科杂志,2004,6(1):50-53.

[6] Silverstein ME,Chvapil M.Experimental and clinical experiences with collagen fleece as a hemostatic agents[J].J Trauma,1981,21(5):388-393.

[7] 戴朝六.肝切除手术中的出血与止血[A].2006国际普通外科论坛暨第十三届全国普外基础与临床进展学术交流大会[C].成都,2006.

[8] Crean S,Michels SL,Moschella K,et al.Bovine thrombin safety reporting: an example of study design and publication bias[J].J Surg Res,2010,158:77-86.

[9] Shoulders MD,Raines RT.Collagen structure and stability[J].Ann Revi Biochem,2009,78(78):925-958.

[10] John GM,Ian W.Modern hemostatic agents for hemorrhage controla review and discussion of use in current combat operations[J].Trauma Mgt,2005,78:76-79.

[11] 段志广.类人胶原蛋白止血海绵的性能研究[D].西安:西北大学,2008.

[12] 周磊.生物材料用胶原蛋白的交联及其表征[D].成都:四川大学,2005.

[13] 姚理荣,林红,陈宇岳.纺织科学技术—纺织材料—胶原蛋白纤维的性能与应用[J].中国学术期刊文摘,2007,(6):7-8.

[14] 王瑞瑞,王鸿儒.胶原蛋白自组装生物功能材料的研究进展[J].化工进展,2017,36(6):2215-2221.

[15] 于金泽.植入性胶原蛋白改性涤纶人造头发的制备与性能研究[D].青岛:青岛大学,2014.

Study on Hemostatic Effect of Collagen Hemostatic Sponge in Pig Liver Hemorrhage Model

LIN Zhenhua, HOU Li, DONG Chuanjun, WEI Zhenxi, ZHU Fuyu, CHU Xiangyu, ZHAN Rongkai
Shandong Provincial Inspection Center for Medical Devices/Key Lab of Biological Evaluation of Medical Devices of Shandong Province, Jinan Shandong 250101, China

Abstract:ObjectiveBy comparing the hemostasis time, bleeding volume and local tissue reaction of two groups of collagen hemostatic sponge and common gauze in the liver trauma model of pigs, an effective bleeding wound model was established for the evaluation of absorbable hemostatic materials in animal experiments. At the same time, it provides reference for the clinical application of collagen hemostatic sponge.MethodsEighteen experimental miniature pigs (female without pregnant, body weight 30～40 kg) were randomly divided into three groups (group A: collagen sponge group; group B: medical collagen sponge group;group C: normal gauze group). A model of hepatic hemorrhage was established in each pig. The hemostatic time and amount of bleeding of collagen hemostatic sponge and gauze were measured quantitatively. After 8 weeks, the formation of blood capsule of wound was observed in anatomical animals, and HE staining was used to observe the inflammatory reaction and wound healing in the injured liver tissue.ResultsThe hemostasis time of group A, B and C were (215.00±69.50), (205.00±48.06) and(480.00±90.99) s, respectively. The hemorrhage volume was (3.08 +1.65), (2.71 +1.34) and (15.77 +3.58) g, respectively. There were significant statistical differences in hemostasis time and hemorrhage volume among group A, B and group C (P＜0.05). The pathological observation showed that there was no in flammatory reaction in all animal liver wounds, no bloody capsule was found,and the wound healed well.ConclusionPorcine liver hemorrhage model can effectively evaluate the effectiveness of hemostatic materials in this model. Collagen hemostatic sponge has a significant hemostatic effect compared with the normal gauze.

通讯作者：侯丽，高级工程师，主要研究方向为医疗器械生物学评价。

基金项目：“十三五”国家重点研发专项支持（2016YFC1103202）。

胶原蛋白止血海绵在猪肝脏出血模型中止血效果研究

引言

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器

1.2 实验动物及分组

1.3 实验方法

1.4 主要观察指标

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 止血时间和出血量

2.2 病理学检查

3 讨论