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1. 海口市人民医院，海南海口 570208；2. 竹脚妇幼医院儿科医学学部，新加坡 299899，新加坡

[摘要]激光诱导自体荧光（LIAF）诊断技术是利用正常组织与癌变组织自体荧光光谱及强度存在明显差异来诊断病变，克服常规取样活检容易出现微小病变和较深层病变漏检的缺点，使临床诊断早癌变为现实。该系统在相同条件下对海口市人民医院消化内镜中心41个患者进行在体连续LIAF光谱检测和分析，以磷状细胞癌光谱图为中心分别与正常胃体组织，炎性组织、增生组织等进行横向分析比较查找出其差异性。LIAF光谱检测技术可以明确区分正常组织与癌变组织，实时发现早癌和癌前病变，实现“光活检”。

引言

对癌症的诊断临床目前主要用取样活检，通过病理学这个“金标准”给于确诊，活检是指对组织标本进行病理组织切片检查，有较高的准确率，但缺点是微小病变和较深层病变很容易漏检，为此人们一直在寻找一种能替代活检方法，自体荧光诊断技术就是在这样背景下产生，从而引发了人们对它的探索和研究[1]。激光诱导自体荧光（Laser-Induced Auto fl uorescence，LIAF）诊断技术是采用一定波长的激光作为激发光源，激发组织产生自体荧光[2]，其利用正常组织与癌变组织自体荧光光谱及强度存在明显差异来诊断病变，具有灵敏度高、实时、无损、准确、诊断需时短等特点，使临床诊断早癌普查变为现实[3]。本文以海南省2017年度重点研发计划项目“激光诱导自体荧光技术研究及其诊断消化道早癌的临床应用”为背景，应用LIAF诊断技术在临床上做了在体实验对其理论基础和应用进行了深入的研究与探讨。

1 激光诱导自体荧光的原理及检测系统组成

1.1 激光诱导自体荧光的原理

一束激光照射人体组织后，生物分子吸收了光能，该分子会从基能态跃升到高能态，处于高能态的分子极不稳定，在一定时间内它从高能态返回基能态，以光能形式向外释放之前吸收的外来能量，在此过程中分子会通过自行释放能量而产生荧光，此过程是通过激光诱导而产生自体荧光[4]；早期癌是指病变浸润不超过粘膜下层的癌，其中局限于黏膜层的称为“黏膜内癌”，其特点是癌变病灶小，厚度薄，症状不明显，尤其平坦型或黏膜下病变，更不易发觉，仅凭肉眼和常规的检测手段很难发现，极易漏诊[5]。消化道早癌检测系统就是基于人体生物分子的荧光特性来研究的，自体荧光的光谱特征与生物组织的光学特性有关[6]。由于人体不同组织的生化组成和形态结构不同，因而不同组织具有独特的光学特性和光谱特征，现已发现人体组织有许多较重要的荧光物质，如胶原蛋白（荧光峰400 nm）、黄素腺嘌呤二核苷酸（荧光峰520 nm）、弹性蛋白（荧光峰400 nm）、血卟淋衍生物（荧光峰630 nm和680 nm），正常组织和肿瘤组织由于分化不同，会有不同的生化成分，或者生化成分相似，但各成分比例却不同[7]；因此，正常组织和肿瘤组织在受到同样条件下激光照射时所产生的自体荧光光谱形状和強度即波长曲线不同，因而可根椐荧光光谱形状的差异性来区分他们，相关研究表明肠癌组织，胃癌组织都具有这种特性，使用荧光光谱分析的方法能将他们与正常组织区别开来[8]。

1.2 检测系统组成

检测系统主要由特制光纤、激光器、光谱仪、光谱分析软件、计算机等组成，该系统采用超低功率的半导体激光器产生的激光作为激光光源，光纤传导激光及收集被激发的自体荧光，自体荧光由微型光谱仪负责接收处理。激光波长405 nm，输出功率为5 mW，光纤在内窥镜（活检通道）的辅助下进入人体肠道或胃内从而实现对肿瘤组织的在体实时检测，荧光通过光纤传输到光谱仪，由它对光信号进行采集处理并送入计算机由专业应用软件对荧光谱进行分析处理并通过显示器显示组织荧光光谱曲线图，供临床研究分析诊断[9]。检测系统连接图，见图1。

光谱仪采用美国海洋光学QE Pro高性能光谱仪，具有的高灵敏度与宽动态范围的特性使其成为了同等级中性能最高的微型光谱仪；其波长范围可在185～1100 nm范围内配置，系统信噪比为1000:1，配备了18位A/D转换器，其容纳15000张光谱图的缓冲区可以在高速采集中保证数据的完整性，同时其先进的光学设计与热电致冷器件可以大大提高长时间检测的热稳定性；QE Pro因而具有超高的动态范围，成为当前市场上灵敏度最高的微型光谱仪。激光光源采用波长为405 nm，输出功率5 mW，低功率、高精度、高稳定性的蓝激光器[10]。光纤探头由定制的七根光导纤维组成，中间一根为发射光纤，激光束通过它照射到待测组织，周围六根为接收光纤，作用是收集荧光并将光信号输入光谱仪进行处理[11]。光纤探头一方面将激光传送到待检组织表面，另一方面收集弱荧光信号并耦合至光谱仪，为了能伴随内窥镜检查时做弯曲动作，光纤探头前端做的较短以便光纤前端能随内窥镜头部弯曲而弯曲，同时光纤材料必须具有很好的挠度，利用石英光纤透过率高适应长距离传输且光信号衰减小等特征[12]；针对胃体组织检测的要求，我们专门定制了一根2.8 m长传输丫型光纤；光纤的一头通过内窥镜活检口接触待检组织，另一头的分叉一端连接激光光源，另一端连接光谱仪。

我们在硬件平台搭建时对部件进行优化组合，其特点是在激光器金属外壳上增加导热材料和风扇散热，解决激光器运行时产生的热量及时散发，同时在集成封装的外壳上增加空气对流口；内置专用主板主要是通过软件达到对激光器和光谱仪等设备的控制，使用独立电源同时供电驱动激光器、控制主板、光谱仪。集成内部采用短光纤在不影响信号收集时，节约了大量设备内部空间使得集成外观更简洁。

操作软件采用SpecSuite光谱分析软件可连接美国海洋光学全系列光谱仪，获取光谱测试数椐，它是一个完全模块化的光谱软件平台，运行在Win2000，XP，Vista，Win7（32位）操作系统，具有采集、调度、多样图谱数据处理等功能，每个功能都是一个独立的模块，可以添加或删除模块为建立一个专有的用户界面或功能，能在创建的模块上进行计算、自动化实验程序等[13]。

2 临床实验结果

对激光诱导自体荧光检测系统进行调试，包括波长校准和响应特性校准，我们把系统应用于胄组织在体自体荧光光谱的检测和分析，由于研究表明在体标本与离体处理过标本的自体荧光光谱存在较大的差异[14]；因此本实验全部为电子胃镜检查时进行在体胃组织自体荧光光谱的检测，同时对病变组织标本取样，所有诊断以病理诊断结果为准，在相同条件下（QE Pro光谱仪使用参数为积分时间为50 ms，平均次数为10次，平滑宽度为5，波段：480～750 nm）对海口市人民医院消化内镜中心41个患者进行连续LIAF光谱检测和分析，其中男性26例，女性15例，年龄26～82岁依据病理诊断结果共测试了6个糜烂性胃炎，11个活动性胃炎，3个表浅性胃炎，6个萎缩性胃炎，3个胃溃疡，7个增生性息肉，3个鳞状细胞癌，2个管状腺瘤和41个正常组织；并从以上病例中选出典型的自体荧光光谱曲线图，见图2，以磷状细胞癌光谱图为中心分别与正常胃体组织，炎性组织、增生组织等进行横向分析比较查找出其差异性。

图2 典型的自体荧光光谱曲线图

注：a. 胃体正常组织与糜烂性胃炎组织自体荧光光谱图；b. 胃体正常组织与慢性活动性胄炎组织自体荧光光谱图；c. 胃体正常组织与增生性息肉组织自体荧光光谱图；d. 胃体正常组织与慢性溃疡组织自体荧光光谱图；e. 胃体正常组织与管腺瘤组织自体荧光光谱图；f. 胃体正常组织与鳞状细胞癌组织自体荧光光谱图。

分析图2a～f以及测量获的所有自体荧光光谱，发现胃体正常组织与胃炎、增生及癌变组织的自体荧光光谱发现有以下一些特征，不论是正常组织还是炎症组织、腺瘤组织、增生组织和癌变组织主峰都为700 nm，有两个左右次峰分别为670 nm和720 nm，主峰的宽度（约30 nm）明显比次峰的宽度（约10 nm）大；胃体正常组织的光谱强度计数单位在1200～1800之间，同一病人正常组织的光谱主峰强度计数（为1800）高出鳞状细胞癌组织对应位置光谱强度（计数单位为950）近二倍，左右侧次峰分别比正常组织对应位置低400～1000计数单位，荧光强度减弱的原因可能是肿瘤组织粘膜层厚度增加导致的[15]，整个光谱呈剪刀状；在波长为500 nm时，光谱图上下曲线强度差最大为8500个计数单位比炎症、增生、腺瘤等组织有明显差别（光谱图上下最大强差：糜烂胃炎组织为1200个计数单位，慢性活动性胃炎组织为3000个计数单位，慢性溃疡组织为3000个计数单位，管腺瘤组织为3300个计数单位），从图2a～f中鳞状细胞癌组织光谱曲线上能看到480、550、580 nm左右有坡谷形成，而正常组织、炎症组织、腺瘤组织、增生组织的光谱图550、610 nm左右有波谷形成，位置也比较固定，研究表明这些波谷认为是由于血红蛋白在这些波长位置的强吸收作用而造成的，它的吸收效应对癌变组织的作用更大[16]；从图2a～f中可见癌变组织光谱图曲线从波长580 nm到左次峰670 nm之间呈上升趋势，而正常组织正好相反出现下降趋势，炎症、溃疡、增生、腺瘤等组织与正常组织的光谱图曲线在该波段却呈现出相同下降趋势。

3 讨论

从临床实验表明，LIAF光谱检测技术可以明确区分正常组织与癌变组织，使早期诊断癌症变为可能，具有发展的应用前景；从光谱图可见胃炎症组织在强度上比正常组织低，而息肉组织强度却比正常组织高，正常组织比癌变组织光谱强度高了近二倍，癌组织产生较弱的荧光与激发光难于穿透癌组织激发到黏膜下层的荧光物质有关[17]；由于癌变组织的血流丰富，血红蛋白对紫外光的吸收，造成绿—黄荧光的减弱和红色荧光的相对增强[18]；或许与胃组织癌变后胶原含量不同导致荧光减少有关，还需在今后的研究中以证实。

致谢

感谢海南省科学技术厅将“激光诱导自体荧光技术研究及其诊断消化道早癌的临床应用”为2017年海南省重点研发计划立项，并提供经费支持，同时感谢消化内镜中心医护人员对这一科研项目的支持与合作。没有大家的共同努力，我们无法完成这一课题，也无法取得这样的成绩。

[1] 刘飞,王鑫,白净.荧光分子成像技术在肿瘤检测中的应用[J].生物医学工程学杂志,2010,27(5):1152-1158.

[2] 朱明宇,常玮,廖筑秀,等.荧光诊断技术在临床中的应用与展望[J].医疗卫生装备,2018,39(2):13-17.

[3] 沙鹏.消化道早癌诊断的常用内镜及诊断进展[J].医疗装备,2018,31(6):200-201.

[4] 张先增,谢树森,林慧韫.生物组织激光消融阀值的光谱特性[J].激光生物学报,2006,15(1):97-100.

[5] 赵九龙,杨帆,李兆申.早期食管癌及癌前病变的内镜下筛查和精查进展[J].中华消化内镜杂志,2015,(5):338-340.

[6] 蔡世伦,钟芸诗,姚礼庆.放大内镜窄带成像技术在消化道早癌诊断中的应用进展[J].中华消化内镜杂志,2014,31(12):748-753.

[7] 张浩,陈世耀.荧光内镜及其在胃肠道肿瘤早期诊断中的应用[J].中华消化内镜杂志,2013,30(4):238-240.

[8] 付玲,袁菁,王家福,等.多光谱荧光共聚焦内窥显微成像系统研究[J].中国医疗器械信息,2015,(10):6-9.

[9] 李伟军,郭萍,王振华.激光诱导自体荧光谱在肿瘤诊断中的比较研究[J].衡阳师范学院学报,2005,26(3):60-62.

[10] 欧辉彬,傅昇.基于自体荧光诊断技术的早期肿瘤检测系统的研究[J].中国医疗设备,2015,30(4):28-31.

[11] 叶衍铭,戈之铮,萧树东,等.荧光内镜在医疗诊断中的应用观察[J].中国医疗器械杂志,2013,(6):457-459.

[12] Kusunoki Y,Imamura F,Uda H,et al.Early detection of lung cancer with laser-induced fluorescence endoscopy and spectro fl uorometry[J].Chest,2000,118(6):1776.

[13] 汤陌生.自体荧光成像技术在乳腺癌和结肠诊断中的应用[J].中国医疗设备,2014,29(4):33-35.

[14] Fu S,Chia TC,Kwek LC,et al.High sensitivity of laser-induced autofluorescence spectra for detection of colorectal cancer with an artiflcial neural network[J].Appl Opt,2005,44(19):4004-4008.

[15] Schleier P.ALA-based fl uorescence diagnosis of malignant oral lesions in the presence of bacterial porphyrin formation[J].Proc SPIE,2006,6139:613908-613908-8.

[16] 于常青.激光诱导荧光技术在生物医学中的应用研究[D].北京:北京理工大学,2001.

[17] 李为光.消化内镜自发荧光技术[J].胃肠病学,2007,12(7):435-438.

[18] 谭学滨,马小红.消化内镜技术用于消化道早癌诊断治疗价值研究[J].临床医药文献电子杂志,2018,5(5):14.

Detection Systems Research and Clinical Experiment of Laser-Induced Autologous Fluorescence of Gastric Tissue to Diagnose Early Cancer

CHEN Zhengyi1, OU Huibin1, FU Sheng2, LIN Songting1, ZHONG Wenzhou1
1. Haikou People’s Hospital, Haikou Hainan 570208, China;2. Department of Pediatrics, KK Women’s and Children’s Hosptial, Singapore 299899, Singapore

Abstract:The laser-induced auto fl uorescence (LIAF) diagnosis technique can diagnose lesions by using the difference in the auto fl uorescence spectrum and intensity of normal tissue and cancerous tissue. This technigue overcomes the shortcomings of routine sampling biopsy that are prone to small lesions and deeper lesion missed detection, making clinical diagnosis of early cancer a reality. Under the same conditions, the system performed in vivo LIAF spectroscopic detection and analysis on 41 patients in the Digestive Endoscopy Center of Haikou People’s Hospital. Taking the phosphatidyl cancer spectrum as a center, and lateral analysis and comparison with normal body tissues, inflammatory tissues, and hyperplasia tissues revealed differences. LIAF spectral detection technology can clearly distinguish between normal and cancerous tissues, real-time detection of early cancer and precancerous lesions, and achieve “photo biopsy”.Keywords: laser-induced; auto fl uorescence; cancerous tissue; spectral detection

激光诱导胃体组织自体荧光诊断早癌的检测系统研究及临床实验

引言

1 激光诱导自体荧光的原理及检测系统组成

1.1 激光诱导自体荧光的原理

1.2 检测系统组成

2 临床实验结果

3 讨论

致谢