牛血清白蛋白作为生物医用材料产品体液免疫评价阳性对照物的研究

杜晓丹,方玉,王春 仁,陈鸿波,杨昭鹏

中国食品药品检定研究院医疗器械检定所,北京 100050

[摘 要]目的 本文旨在对生物医用材料免疫原性评价方法进行初步探索,寻找有效的生物医用材料产品体液免疫评价所需阳性对照物,并对其使用剂量,免疫方法和免疫效果进行探索,为生物医用材料产品免疫原性评价实现标准化积累数据。方法 选取雌性8周Balb/c小鼠,随机分组,分别不同剂量免疫3次,每次间隔两周。分别摘眼球取血,分离血清,并进行血清抗体总IgG浓度检测,实验结果利用统计学方法进行分析。结果 牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)单独免疫小鼠均无显著的体液免疫刺激作用;BSA混合佐剂免疫小鼠中剂量组和高剂量组的淋巴细胞增值能力明显强于阴性对照组,高剂量组强于中剂量组;二次免疫后两周取材与3次免疫后两周取材BSA混合佐剂组细胞增殖能力均与阴性对照组有显著性差异,3次免疫后两周强于二次免疫后两周,佐剂对照组与阴性对照组淋巴细胞增值能力无显著性差异。结论 实验证明,BSA可以作为生物医用材料产 品体液免疫检测的阳性对照物,免疫刺激强度适中。

[关键词]牛血清白蛋白;体液免疫;阳性对照物;生物医用材料;免疫刺激

引言

生物医用材料的免疫原性通常比较低,因此对其展开体液免疫评价工作就需要找出一种具有适当的免疫刺激作用,刺激程度不强不弱的物质作为检测所需的阳性对照物。而牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)除具有以上特性外,也是ASTM标准F1905-98《材料致免疫毒性测试方法选择标准规范》中推荐的材料体液免疫检测阳性对照物[1-2]。因此,本文对BSA用于生物医用材料体液免疫阳性对照物的使用剂量,免疫方法和免疫效果进行了一系列实验。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

本试验在中国食品药品检定研究院,生物材料与组织工程实验室完成,采用随机分组设计,对照动物实验的模式,选取SPF级雌性Balb/c小鼠,饲养许可证SCXK(京2005-0004)为试验动物。使用的仪器包括:净化工作台(HDL BCN-1360B),离心机(sigma 3k15),牛血清白蛋白(北京欣经科生物技术有限公司),酶标仪(Therm o MSS),超纯水仪(MilliPore),振荡仪(AKI),-80℃冰柜(Thermo),小鼠血清总IgG定量检测试剂盒(Cat#:6320 ALPHA DIAGNOSTIC),小鼠血清总IgM定量检测试剂盒(Cat#:6380 ALPHA DIAGNOSTIC)。

1.2 方法

1.2.1 BSA单独免疫小鼠实验

雌性8周Balb/c小鼠28只,随机分为4组,每组7只。免疫3次,每次间隔两周,3次免疫两周后取材。阴性对照组:每只小鼠皮下注射0.1 mL PBS。BSA高、中、低剂量组:每只小鼠皮下注射0.1 mL BSA的PBS水溶液,每组BSA的PBS水溶液的浓度分别为1000、500、100 μg/mL。取材方法:摘眼球取血,分离血清,用ELISA试剂盒检测血清中总IgG浓度[3-9]

1.2.2 BSA加佐剂免疫小鼠实验

雌性8周Balb/c小鼠24只,随机分为4组,每组6只。免疫3次,每次间隔两周,3次免疫两周后取材。阴性对照组:每只小鼠皮下注射0.1 mL PBS。BSA高、中、低剂量组:首次免疫:BSA的PBS水溶液+弗氏完全佐剂(1:1混合,1000、500、100 μg/mL),每只小鼠皮下注射0.1 mL,加强免疫:BSA的PBS水溶液+弗氏不完全佐剂(1:1混合,1000、500、100 μg/mL),每只小鼠皮下注射0.1 mL。实验操作同上。

1.2.3 BSA免疫次数及时间点的选择

雌性8周Balb/c小鼠36只,随机分为6组,每组6只。分为3个取材时间点,两个实验组:二次免疫后两周(BSA+佐剂组、阴性对照组),3次免疫后两周(BSA+佐剂组、阴性对照组)和3次免疫后4周(BSA+佐剂组、阴性对照组)免疫3次,每次间隔两周。BSA+佐剂组:首次免疫:BSA的PBS水溶液+弗 氏完全佐剂(1∶1混合,1000 μg/mL),每只小鼠皮下注射0.1 mL,加强免疫:BSA的PBS水溶液+弗氏不完全佐剂(1∶1混合,1000 μg/mL),每只小鼠皮下注射0.1 mL。阴性对照组:每只小鼠皮下注射0.1 mL PBS[10-13]。实验操作同上。

主要观察指标:① 观察BSA单独免疫小鼠的免疫效果;② 观察BSA混合佐剂免疫小鼠的免疫效果;③ BSA作为生物医用材料产品体液免疫阳性对照物的使用剂量;④ BSA作为生物医用材料产品体液免疫阳性对照物适宜的免疫、取材时间。

1.2.4 统计学分析

采用SPSS 11.5进行数据处理,所有观察指标以表示,计量资料采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BSA单独免疫小鼠实验

试验发现,BSA高中低3个剂量组中:中剂量,高剂量组虽比阴性对照组绝对值高,但与阴性对照组IgG水平几乎相当,并没有产生较强的体液免疫刺激作用。BSA高中低3个剂量组与阴性对照组比较,血清总IgG浓度均无统 计学差异(P>0.05)。因此,在此剂量下,以BSA单独免疫小鼠作为生物医用材料体液免疫检测阳性对照物是不可行的。BSA单独免疫小鼠的各实验组血清总IgG浓度均值,见表1。

表1 BSA单独免疫小鼠血清总IgG水平(μg/mL)

2.2 BSA加佐剂免疫小鼠实验

本次试验采用与前次试验相同批号试剂盒进行,且本次试验意在高中低3个剂量组之间进行比较,不需得到IgG的绝对浓度,因此以各组吸光度数值直接进行比较。从BSA加佐剂免疫小鼠血清总IgG检测的各组吸光度数值可见,高中低3个剂量组IgG水平与阴性对照组比较均有升高,其中高剂量组最为显著,因此可以判断,BSA加佐剂免疫方式可以作为生物医用材料体液免疫检测阳性对照物,并应选择高剂量作为生物医用材料体液免疫检测阳性对照剂量。BSA加佐剂免疫小鼠血清总IgG水平,见表2。

表2 BSA加佐剂免疫小鼠血清总IgG水平(吸光度值)

2.3 BSA免疫次数及时间点的选择及对佐剂作用的观察

本次试验选用前期试验总结出的高剂量混合佐剂免疫小鼠,选择了3个取材时间点,并添加佐剂对照组,集中对免疫次数,取材时间点以及佐剂的作用进行评测。不同取材时间点各实验组的小鼠血清总IgG浓度均数,见表3。阳性组与阴性对照组进行独立样本t检验,佐剂组与阴性对照组进行独立样本t检验,统计各组间有无统计学差异。

二次免疫后两周,BSA+佐剂组小鼠血清总IgG水平明显高于阴性对照组,P<0.05,差异据统计学意义。3次免疫后两周,BSA+佐剂组的小鼠血清总IgG水平明显高于阴性对照组,P<0.01,差异具统计学意义。3次免疫后4周,BSA+佐剂组小鼠血清总IgG水平与阴性对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。佐剂对照组与阴性对照组比较:二次免疫后两周P>0.05没有显著性差异,说明BSA在佐剂的辅助下起到了较好的免疫刺激作用;3次免疫后两周P值进一步减小,依然与阴性对照组无显著性差异,说明佐剂的免疫作用得到进一步放大,在阳性对照物免疫刺激过程中起到了良好的免疫辅助作用,并没有掩盖阳性对照物的免疫刺激作用,辅助阳性对照物体液免疫检测产生较明显的阳性结果。因此BSA可以作为生物医用材料产品体液免疫检测阳性对照物使用,而3次免疫后4周取材的小鼠BSA组与阴性对照组小鼠血清总IgG水平t检验结果P值为0.433>0.05没有显著性差异,说明在免疫后4周时免疫水平已有所下降,因此较好的取材时间点应为3次免疫后两周。各时间点和实验组小鼠血清总IgG水平,见表3。

3 讨论

目前,对各类药品、生物制品开展的免疫原性研究很多,但对医疗器械,特别是生物医用材料的免疫原性研究还不够深入。这主要是由于生物医用材料与药品在用途及物化特性上的不同,使得一些应用于药品的成熟试验方法在应用于生物医用材料时不适用造成的。而目前无论是国际还是国内,对生物医用材料产品开展免疫原性评价均无标准方法,现存的均为一些方向建议和指导原则[14-20]

本文即是通过可行性分析后,通过小鼠体内实验,初步探讨了BSA作为生物医用材料产品体液免疫检测阳性对照物的可行性,剂量,实验方法,免疫时间等。希望能够起到抛砖引玉的作用,为生物医用材料产品免疫原性检测方法的建立贡献力量。

4 结论

随着医学技术的发展,生物医用材料也在临床中得到越来越广泛的应用,国家针对这一趋势,做出了对各种生物医用材料进行免疫原性检测的要求,由于生物医用材料产品与疫苗等生物制品有所不同,往往存在各种物理化学特性,而且免疫原性较低,因此需要根据材料的特性对其进行免疫原性检测方法的建立。本文即是探索具体检验方法建立至关重要的一环-阳性对照物的选取和具体应用方法。

实验证明,BSA可以作为生物医用材料产品体液免疫检测的阳性对照物,免疫刺激强度适中。具体应用方法为:雌性8周balb/c小鼠免疫3次,间隔两周。首次:BSA的PBS水溶液+弗氏完全佐剂(1∶1混合,1000 μg/mL),皮下注射0.1 mL/只;加强免疫:BSA的PBS水溶液+弗氏不完全佐剂(1∶1混合,1000 μg/mL),皮下注射0.1 mL/只;最佳取材时间点为3次免疫后两周。

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表3 各时间点和实验组小鼠血清总IgG水平(μg/mL)

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本文编辑 袁隽玲

Study on BSA as a Positive Control for Humoral Immunity Evaluation of Medical Biomaterial

DU Xiao-dan, FANG Yu, WANG Chun-ren, CHEN Hong-bo, YANG Zhao-peng

Institute for Medical Devices Control, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China

Abstract:Objective This text was aimed to search a valid humoral immunity positive control based on the tentative exploration analysis of the immunogenic evaluative method of medical biomaterial. Meanwhile, the recommended dosage, immune method and immune effect was aimed to explore. Methods A group of 8 weeks’ female Balb/c mice were randomized assigned into groups. Different doses of bovine serum albumin (BSA) were use d to immune the mouses 3 times, each time spaced for 2 weeks. The eyeball blood were separately gained and the serum were segregate to detect the serum total IgG antibody concentration. The experimental results were analyzed by statistical methods. Results The Mouse immuned by BSA alone did not show signif i cant humoral immunity stimulative effect in all the dosages. The mouse that BSA mixed adjuvant, serum IgG of the middle dose and the high dose were much higher than the negative control, and the ability of high dose was higher than the middle dose. It was signif i cant different between the serum IgG of the group executed 2 weeks after immuned for 2 times and the negative control group, as well as the group executed 2 weeks after immuned for 3 times and the negative control group. Serum IgG of the group executed 2 weeks after immuned for 3 times was higher than the group executed 2 weeks after immuned for 2 times. The adjuvant control group di d not show signif i cant difference with the negative control group. Conclusion The experiment indicated that BSA could be used as a humoral immunity positive control of the immunogenic evaluation of the medical biomaterial.

Key words:bovine serum albumin; humoral immunity; positive control; medical biomaterial; immunostimulation

[中图分类号]R331

[文献标识码]A

doi:10.3969/j.issn.1674-1633.2017.05.008

[文章编号]1674-1633(2017)05-0032-03

收稿日期:2016-12-30

修回日期:2017-02-13

通讯作者:杨昭鹏,主任药师,主要从事医疗器械安全有效性评价方向的研究。

通讯作者 邮箱:kilei007@163.com