质谱仪在乳腺癌生物标记物研究中的应用唐武芳 1，吴超超 2，范海伟 2，高强 2 1.江苏盐城市城南医院 设备处，江苏盐城 224001；2.浙江佰辰医疗科技有限公司 研发部，浙江 杭州 310030 [摘 要]乳腺癌是一种威胁女性健康的常见恶性肿瘤，目前临床上主要依据组织病理学要素对乳腺癌进行病情预测和治疗。以生物标记物的发现和确认为核心的临床蛋白质组学研究逐渐成为了乳腺癌研究的主流方向，这大大提升了临床对乳腺癌分子机理的认识，并推动了对乳腺癌的临床诊断及预后。本文主要对质谱仪在乳腺癌生物标记物研究中的应用进展进行综述。首先介绍了基于质谱的蛋白质组学的基本概念，然后具体阐述了质谱技术中的一些最新研究进展以及相关技术在乳腺癌生物标记物研究中的应用，并且还分析了一些利用质谱技术寻找到的潜在乳腺癌生物标记物及其应用前景，最后对质谱技术应用于该领域的局限性以及未来发展趋势进行了展望。 [关键词]质谱分析；乳腺癌；生物标记物；蛋白质组学；同位素标记 引言乳腺癌是一种威胁女性健康的常见恶性肿瘤，是女性中致死率第二高的癌症 [1]。随着乳房X射线透视技术应用于乳腺癌筛查工作以及乳腺癌综合治疗的开展，自20世纪90年代开始，全球乳腺癌死亡率呈现出下降趋势 [2-3]。然而，至少有20%的病人仍然出现了癌细胞的转移，最终导致严重的后果。目前临床上主要依据组织病理学要素对乳腺癌进行病情预测和治疗，包括肿瘤大小、肿瘤级别、结节状态以及性激素和人类表皮生长因子受体II状态等。而，即使乳腺癌病人在肿瘤组织学上相似，最终病情发展却不尽相同，呈现出高度的异质性。所以针对乳腺癌，临床上仍然需要合适的生物标记物来进行早期诊断、病人分型、预后、疗效监测以及复发风险评估 [4-5]。 近年来，随着二代测序技术的快速发展，基因组表达谱被认为是一种可以实现癌症分类和预后的可靠方法，该方法基于基因层面的差异表达分析，从而实现不同类型癌症、癌症不同时期的区分。Perou等 [6]在2000年分析了8102个基因的互补DNA（cDNA）芯片，将乳腺癌分为4个分子亚型。然而，基因功能最终是通过翻译成的活性蛋白质体现的，而且在关键生物进程中往往还存在着RNA的可变剪切以及蛋白质的翻译后修饰（例如磷酸化、糖基化、泛素化、乙酰化、甲基化等）。蛋白质是基因表达的最终产物，因此针对蛋白质组学的研究可以更加直观和深入地了解癌症发病的分子机理和进程。此外，蛋白质往往通过特定的通路展现生物功能，针对肿瘤发生所关联的特定蛋白通路研究对癌症治疗具有重要的意义。因此，以生物标记物的发现和确认为核心的临床蛋白质组学研究逐渐成为了乳腺癌研究的主流方向，这大大提升了临床对乳腺癌分子机理的认识，并推动了对乳腺癌的临床诊断及预后。 相比较于传统的以电泳法以及免疫反应法为核心的蛋白质组分析平台，以质谱为核心的新分析平台逐渐显现出其独特的优势。质谱技术可以实现对临床上多种样品进行微量检测，包括血清或血浆、唾液、乳汁溢液和尿液等；同时质谱可以对未知蛋白进行研究，并不需要像酶联免疫吸附试验、免疫组化或免疫印迹等方法那样需要特异性的抗体；此外，质谱分析技术还具有高精准度、高重复性、高通量等优势。事实上，基于质谱技术的蛋白质组学分析已广泛运用于乳腺癌研究领域，通过对不同样品进行蛋白质组学分析，从而筛选得到能够用于诊断、治疗监测以及预后判断的乳腺癌潜在生物标记物。本文就目前质谱在乳腺癌生物标记物研究中的应用和进展进行总结。 1 应用于乳腺癌生物标志物研究的质谱技术1.1 多重反应监测 多重反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）技术作为一种高特异性、高灵敏度的质谱数据获取方式，逐步受到生物标志物研究者们关注，成为定量蛋白质组学研究中的重要技术 [7]。在三重四级杆质谱中，利用第一重四级杆筛选出符合设定（质荷比，m/z）的母离子进入碰撞室，在碰撞室（第二重四级杆）内完成母离子碎裂后，通过第三重四级杆进行子离子的筛选，只让特定质荷比的子离子通过，结合母离子和子离子的双重选择，去除了其他背景干扰离子，大大提高了检测灵敏度和准确性。该种扫描模式可以同时监测多个母离子/子离子对，从而实现与同一疾病相关的多个生物标记物的同时检测。同时，该技术可以针对某一目标蛋白的多个肽段进行监测，这就可以实现对发生翻译后修饰的蛋白进行鉴定 [7-8]。 该技术在癌症蛋白组学研究中的应用已日渐成熟，在许多乳腺癌的研究中都已经采用该技术对血清和组织样品中的潜在生物标记物进行定量检测 [9-10]。同时，该技术也不断在发展，已有研究将免疫法与MRM进行结合，在进行MRM扫描定量前，先利用特异性蛋白抗体进行免疫富集 [10]。此外，针对乳腺癌动物模型以及细胞系，也都已有利用MRM技术进行蛋白质组定量分析的研究报道 [11-12]。 1.2 同位素标记相对和绝对定量 同位素标记相对和绝对定量（isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation，iTRAQ）作为一种蛋白标记技术，利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团，经高精度质谱仪串联分析，可同时比较多达8种样品之间的蛋白表达量，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术。该技术先是将蛋白质裂解为肽段，然后用iTRAQ试剂（AB Sciex）特异性标记多肽的氨基基团，用串联质谱方法对在第一级质谱检测到前体离子进行碰撞诱导解离，产物离子通过第二级质谱进行分析。二级质谱中由于质量平衡基团丢失，产生了不同质荷比的报告离子，通过对不同报告基团离子强度的检测就实现了对它所标记的多肽的相对丰度检测。因此，该技术可以实现多个样品蛋白含量的直接比较以及样品的重复分析比较 [13]。 一项针对20组受试者的乳腺癌病例对照研究中，利用了iTRAQ技术对受试者血清标记物进行了定量，结果发现共有32个蛋白至少在14组受试者中发生了变化，而其中有4个蛋白在阳性受试者的血清中出现显著的改变 [14]。而另一项研究中，利用iTRAQ标记技术对3类乳腺癌组织样本进行了比较，分别是非转移性原位组织、转移性原位组织和淋巴结转移组织 [15]。通过蛋白差异分析最后鉴定出了一些潜在的与癌症转移相关的蛋白，然而由于样品量限制，降低了这一研究结果的可靠性。相关的研究还有很多，比如iTRAQ技术已经用于乳腺癌细胞模型研究，用于鉴定出一些与治疗抗性或药物敏感性相关的潜在生物标记物 [16-17]。 1.3 表面增强激光解析电离质谱相关技术 表面增强激光解析电离质谱相关技术（Surface-enhanced Laser Desorption Ionization-time of Flight Mass Spectrometry，SELDI-TOF-MS）是一种可以实现样品一步分离以及高通量检测的蛋白质组分析方法。利用具有不同化学表面的芯片，选择性的结合一组蛋白质，然后利用激光束能量进行分子电离并送入质量分析器。该技术将表面增强的选择性捕获与高分辨率的飞行时间质谱法相结合，以获得蛋白质图谱和发现生物标志物。该技术甚至可以对50～100个肿瘤细胞或是0.1血浆（5L血浆稀释50倍）实现高质量检测 [18]，因此在临床、蛋白质组学等研究领域得到广泛地应用。 SELDI-TOF-MS已经广泛应用于乳腺癌的血清、乳汁溢液、组织和乳腺导管灌洗液的标记物检测。Li等 [19]采用该技术鉴定出了3个血清生物标记物，经验证其敏感性和特异性分别为93%和91%。 1.4 质谱成像技术 质谱成像技术（Imaging Mass Spectrometry，IMS）是一种新型的组织成像技术，该技术使用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对直接来源于组织切片中的肽和蛋白质进行剖析和成像，以便获得有关这些肽和蛋白质局部相对丰度和空间分布的精确信息。该技术已经发展成为包括乳腺癌在内众多癌症生物标记物发现的有效手段 [20-21]。 Bauer等 [22]通过利用IMS技术，比较了来自于新辅助紫杉醇治疗和放射治疗后病情完全缓解的乳腺癌病人和仍然有残留病灶的乳腺癌病人的组织切片，结果发现Defensin家族蛋白可以作为乳腺癌病人病理完全缓解的一个标志；另外一项研究则利用IMS技术探究HER2阳性乳腺癌组织中的蛋白标记物，最终鉴定到一个富含半胱氨酸蛋白1（CRIP1），作为判断HER2阳性型乳腺癌的一个高灵敏性和特异性的标记物 [20]。随着激光技术的发展，使得质谱成像技术具有更大的数据获取量，预示着这项技术在今后的生物标记物开发领域中会具有更为广泛的应用。 2 乳腺癌相关生物标记物对于目前乳腺癌的临床蛋白质组学研究，主要集中在两个方面：一是针对乳腺癌寻找新的生物标记物研究；另一个则是针对引起乳腺癌以及癌症病情发展相关的信号转导通路的研究，借此筛选用于预后和治疗效果预测的标记物以及新的药物靶点。这些研究为今后乳腺癌的药物治疗研发以及提升治疗效果提供了坚实的基础。其中，有相当大一部分研究都采用了质谱技术对乳腺癌病人特异的蛋白质谱进行分析。 2.1 用于乳腺癌的分型 Sørlie等 [23]利用cDNA微阵列芯片技术，根据基因表达差异将乳腺癌分为4种新的亚型，分别为Luminal A型、Luminal B型、ERBB2阳性型以及Basal-like型。相比较于Luminal型，ERBB2阳性型以及Basal-like型的病人存活期更短。Brozkova等 [24]利用质谱技术从蛋白质组层面证实了这一分类，并发现其中ANX V和HSP27蛋白可以作为乳腺癌的潜在生物标记物。这一新分类与当前根据组织病理学分类有所不同，能够更好地解释为何具有相似组织病理的病例却有不同病情发展的原因。通过基因表达谱和蛋白质表达谱的交叉验证，使我们对乳腺癌的分型有了更加全面和深入的认识，对临床诊断具有重要的意义。 2.2 用于乳腺癌的预后 相比针对乳腺癌诊断方面研究，用于乳腺癌预后的生物标记物研究相对较少。有一项研究报道，通过利用临床蛋白质组学研究方法对乳腺癌细胞系进行了分析，最终发现静止素硫基氧化酶1（QSOX1）蛋白在恶性乳腺癌细胞增殖前、侵染前的进程中扮演着重要的角色，可以作为评估乳腺癌复发风险以及低存活率Luminal B型乳腺癌预后的一种新的生物标记物 [25]。而在另一项研究中，研究团队利用质谱对乳腺癌组织与正常乳腺组织分别进行蛋白定量（同位素标记技术），并结合大群体（n=967）的组织芯片验证，试图筛选出能够用于乳腺癌监测以及预后的新型生物标记物，结果发现，在淋巴结转移的病人中核心蛋白聚糖（Decorin，DCN）具有显著的高表达，在出现远距离转移的病人中内质网素（Endoplasmin，HSP90B19）具有显著的高表达 [26]。此外，该研究还表明，通过对DCN和HSP90B19高表达的病人进行激素治疗，可以显著提升总存活率。而就像其他基于质谱技术的生物标记物发现报道的一样，这些发现的潜在生物标记物需要在独立人群中进行下一步的验证和确认。 研究人员曾经利用传统的蛋白质组学研究方法，筛选出尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂（uPA）以及纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI-1）等蛋白标记物用于淋巴结阴性乳腺癌患者的预后，而后通过运用质谱分析技术，同样筛选出铁蛋白轻链（Ferritin Light Chain，FTL），这一标记物被用于淋巴结阴性乳腺癌患者的预后 [27]。在这一涉及多个中心的研究当中，成功地验证了铁蛋白轻链作为乳腺癌预后标记物的重要价值，FTL的高表达往往预示着该乳腺癌亚型具有更强烈的侵袭性表征 [28]。此外，该研究还表明FTL储存于乳腺肿瘤组织相关巨噬细胞中，因此针对临床上检测发现淋巴结阴性乳腺癌病人的肿瘤FTL高表达以及巨噬细胞中富含铁蛋白，就可以针对性地进行更高频次的监测以及辅助性治疗。 2.3 用于乳腺癌的治疗监测 乳腺癌的治疗监测主要包括术后的肿瘤复发风险评估以及药物疗效监测等，通过对相应生物标记物的跟踪监测，随时调整治疗方案，这对临床乳腺癌的治疗具有重要的意义。He等 [29]通过质谱分析以及ELISA验证，筛选出血清CD14蛋白可作为乳腺癌复发风险评估的潜在生物标记物，若血清中CD14显著降低，可表明病人具有较高复发风险。这一研究表明CD14可以在预后困难的乳腺癌亚型病人的复发预测中扮演重要的角色，而针对该标记物的临床转化，有多个研究团队正在进行验证。 在针对治疗响应相关的标志物研究中，视黄酸受体（Recombinant Retnoid Acid Receptor，RARA）值得更多的关注。在一项研究中，研究人员对乳腺癌细胞系进行了蛋白质组定量从而筛选出RARA蛋白作这一标记物，并在两个独立的病人群体中进行了验证 [30]。研究结果表明了RARA在他莫昔芬抗性病人中扮演着重要的角色，而该蛋白可以作为ER阳性型乳腺癌的预测标记物，同时RARA也是一个潜在药物靶点。该研究采用了对药物他莫昔芬有响应和无响应的两种细胞系，利用质谱分别进行蛋白质组学分析从而筛选出差异蛋白，并通过Western Blotting、ELISA和IHC方法在病人样品上进行验证。通过两个独立的病人群体试验，结果显示在接受他莫昔芬辅助治疗的ER阳性型乳腺癌病人中，肿瘤中RARA含量越高，相应病人的无复发生存期就会缩短。但是仍然需要后续大样本的验证，并且清楚RARA蛋白与他莫昔芬抗性之间生物学关系，才能将这一标记物应用于临床。总之，该试验是蛋白质组学研究中的一个典型，其基于乳腺癌细胞系进行标记物差异表达分析，并在病人群体中得到了后续验证。这一发现对指导高表达RARA的抗他莫昔芬乳腺癌病人用药具有重要的价值。 3 总结乳腺癌作为一种集复杂性以及异质性为一体的典型疾病，针对其的蛋白质组学研究日渐重要。而伴随着以质谱为主的蛋白质组研究工具的不断发展，对于低丰度蛋白也可以实现大批量、高通量的检测、鉴定以及功能分析，进而产生了海量的蛋白质组学数据以揭示乳腺癌分子水平的特征。然而，针对乳腺癌的蛋白质组学研究目前存在主要的局限性还是在于该癌症复杂的生理生化进程，我们仍然无法真正明确究竟是哪些蛋白才是正在触发癌症发生通路的，哪些蛋白是通路激活后发生特异性变化的。这些问题都亟待新的研究去解决。细胞以及肿瘤微环境水平的蛋白质组定量研究揭示了肿瘤发生随着时间推移的分子谱变化，以及在某一时间点上细胞内哪些蛋白质以一种怎样的方式发生着改变，这为我们真正理解乳腺癌发生发展的进程提供了可能。 不同亚型的乳腺癌一般具有不同的病情发展和结局，而如何区分不同的亚型一直以来是临床上需要面对的难题，通过基于质谱的蛋白质组学研究揭示乳腺癌的分子特征是一种非常重要且有效的手段。本文对质谱技术的发展以及乳腺癌生物标记物的研究进行了回顾性综述，进一步明确了如何利用蛋白质组学进行乳腺癌分型、诊断、预后、生物标记物筛选、不同亚型治疗药物响应研究等。虽然筛选出的生物标记物距离真正的临床应用还有一段距离，但是却给我们指明了研究的方向。相信随着质谱技术的进一步发展以及多医学中心的联合努力，包括乳腺癌在内的多种肿瘤标记物的发现、验证以及临床转化都会更进一步。 [参考文献] [1] Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics,2013[J].CA Cancer J Clin,2013,63(1):11-30. 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At present, histopathological factor is the main clinical basis for breast cancer forecast and treatment. Discovery and confirmation of biomarkers based on clinical proteomics study has gradually become the mainstream of breast cancer research, which greatly enhances clinical understanding of molecular mechanism of breast cancer, and promotes the clinical diagnosis and prognosis of breast cancer. This article mainly reriewed the application progress of mass spectrometry in the study of breast cancer biomarkers. Firstly, it introduced basic concept of proteomics based on mass spectrometry, then detailed the latest research progress on mass spectrometry techniques and related application in breast cancer biomarker research, furthermore it also listed some potential breast cancer biomarkers with mass spectrometry as well as their application prospect. Finally, the limitations and future development trend of mass spectrometry in breast cancer biomarker study were also discussed. Key words：mass spectrometry; breast cancer; biomarker; proteomics; isotope labeling [中图分类号]TB774；R737.9 [文献标识码]A doi：10.3969/j.issn.1674-1633.2017.02.025 [文章编号]1674-1633(2017)02-0091-05 收稿日期：2016-10-19 修回日期：2016-11-15 作者邮箱：yctwf@163.com |