针灸针具用含铜不锈钢的抗菌行为研究
孙子晴，任玲，杨柯
[摘 要]本文探讨了304型含铜不锈钢（304-Cu SS）的体外抗菌性能。体外实验结果表明，与普通304不锈钢（304 SS）相比，304-Cu SS对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌均有良好的杀菌作用，并表现出明显抑制细菌粘附和细菌生物膜形成的作用。植入动物实验结果表明，304-Cu SS植入新西兰大白兔肌肉组织后，发挥了明显的抗菌作用，材料表面细菌量，植入部位周围组织病灶感染程度均明显小于和轻于304 SS。因此，304-Cu SS作为针灸针具材料可以有效抑制细菌感染发生，具有广阔的临床应用前景。
[关键词]含铜不锈钢；抗菌；针灸针具；细菌生物膜；医用金属材料
引言
针灸是一种中国特有的治疗疾病的手段，从古代沿用至今。回顾针灸医学近百年的发展历史，针灸工具从最原始的砭石、针砭逐渐演变成金针、银针、马嚼铁针，现在临床上以不锈钢为制针材料者最常用[1-4]。针灸是一种侵入性治疗手段，消毒措施不严格、治疗环境不洁净或患者自身免疫系统不完善等因素均会造成病菌传播引发细菌感染的可能。除了医院采用常规医疗器械消毒流程之外，如果能从针灸针具材料本身改进来赋予其抗菌性能将会是降低上述感染发生的一个有效途径。近年来发展的含铜抗菌不锈钢为这实现这一新的途径提供了可能，本文为此开展了含铜不锈钢在体内外的抗菌行为研究，以期为其作为针灸针具的应用提供支持。
1 材料与方法
1.1 实验材料及动物
本文研究中的实验材料为我院自主开发的304型奥氏体含铜抗菌不锈钢（304-Cu SS），对照材料为普通304奥氏体不锈钢（304 SS）。体外实验样品尺寸为Φ10 mm×1 mm，体内实验样品尺寸为15 mm×3 mm×1.5 mm。选用健康新西兰大白兔8只，体重2～2.5 kg，分笼按要求饲养。实验用新西兰大白兔由青岛康大生物科技有限公司提供。
实验用菌种为革兰氏阴性大肠杆菌ATCC25922（Escher ichia coli, E. coli）及革兰氏阳性金黄色葡萄球菌ATCC25923 （Staphylococcus aureus, S. aureus）由广东省微生物菌种保藏中心提供。
1.2 体外实验方法
1.2.1 抗菌性能实验
严格按照标准抗菌实验方法进行[5-9]，实验所用溶液为浓度为105cfu/mL的大肠杆菌及金黄色葡萄球菌悬液。将实验样片与细菌菌液接触24 h，适当稀释后进行涂平板，在37℃恒温培养箱中培养24 h后进行菌落计数。
1.2.2 细菌粘附实验
将与细菌共培养24 h后的实验材料经无菌PBS清洗3次后，用2.5%戊二醛溶液于4℃条件下固定4 h，经逐级脱水（40%～100%）干燥后，进行扫描电镜观察。
1.2.3 激光共聚焦显微镜观察
将与细菌共培养24 h后的实验材料经无菌PBS溶液清洗3次后滴加染色剂（syto9:PI=1:1），再用无菌生理盐水清洗3次后，在激光共聚焦显微镜下观察[10-11]。
1.3 动物体内实验方法
1.3.1 手术操作
大白兔适应饲养后，按照编号顺序用10%水合氯醛（3～4 mL/kg)腹腔麻醉。将大白兔固定于手术台上，正卧位，备皮，局部消毒。在兔背脊单侧骨骼区距离脊柱2 cm处，手术刀切开长约2 cm的切口，显露肌肉组织，再用止血钳钝性分离背部竖脊肌，形成袋状。将表面附有细菌生物膜的实验片竖直插入肌肉中，每只兔子左侧统一植入304-Cu SS样片，右侧统一植入304 SS样片，并确保其不与脊柱骨组织接触。术后分层缝合伤口，伤口外缘简单消毒，不给予抗生素[12-13]。
1.3.2 实验检测
样品植入白兔肌肉组织时间为7 d，术后每天进行大体观察，包括动物的饮食、活动、体重、肛温及伤口愈合情况（红肿、硬结分泌物、新生肉芽组织、组织张力等）。实验动物处死后，观察植入材料与周围组织的联系，植入材料周围组织是否有化脓、坏死等情况。取出材料后，观察植入材料表面是否完整、有无腐蚀生锈、变色反应等情况，并对样品及植入部位周围组织进行细菌培养及菌落计数[14-15]。
2 实验结果及分析
2.1 抗菌性能
实验材料与大肠杆菌及金黄色葡萄球菌进行共培养的平板计数结果直观地显示出了304-Cu SS的抗菌性能，表明经过24 h接触培养后，304-Cu SS的抗菌能力均达到90%以上，见图1a，直观的菌落照片见图1b。
图1 304-Cu SS和304 SS分别与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌液共培养后的抗菌结果
注：a.菌落计数；b.细菌在培养皿中的分布照片。
2.2 细菌粘附
实验材料与大肠杆菌及金黄色葡萄球菌液经24 h表面接触后，样品表面的细菌粘附情况见图2。可见304 SS表面粘附有大量的细菌，并且有形成生物膜的趋势；而304-Cu SS表面上的细菌量非常少，没有成膜的趋势。因此，无论是大肠杆菌还是金黄色葡萄球菌，304-Cu SS均较304 SS均表现出良好的抑制细菌黏附及细菌生物膜形成的作用。
图2 304 SS和304-Cu SS与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌液接触24 h后的扫描电镜照片
2.3 激光共聚焦显微镜观察
激光共聚焦显微镜观察能直观表明材料与细菌经接触后，样品表面的细菌存活情况，其中绿色代表活细菌，红色代表死亡的细菌。304-Cu SS表面上两种细菌的活细菌数量均明显少于304 SS表面，说明304-Cu SS对以上两种细菌的确具有强烈的杀菌能力，并能抑制细菌生物膜的形成（见图3）。
图3 304 SS和304-Cu SS与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌液共培养后的激光共聚焦图像
2.4 动物体内的抗感染行为
将实验组与对照组的材料与105cfu/mL菌液浓度的金黄色葡萄球菌共培养24 h，使其表面黏附细菌生物膜，模拟针灸针具被感染后扎入人体内的感染模型。7天后取材发现，无论是材料表面细菌数量还是样片周围组织所含细菌量，植入的304-Cu SS 侧均少于植入304 SS 侧。大体观察结果同样可验证304-Cu SS具有明显的抗菌效果（图4），兔背部伤口见明显差异，植入304-Cu SS的左侧伤口无红肿化脓现象，而植入304 SS右侧伤口已明显化脓感染无法愈合。图5为切开后样片植入部位组织解剖观察，可见304 SS周围组织出现化脓性感染，感染面积扩散较大且形状不规则，呈鸡蛋糕状溃烂，并有大量渗出液，感染深度达肌肉层；而304-Cu SS 周围组织略有化脓性感染，感染面积明显小于304 SS侧，且感染深度较304 SS侧浅，仅达筋膜层。
图4 样片植入7天后肉眼直观观察白兔背部表面愈合情况
注：左：植入304-Cu SS；右：植入304 SS。
图5 样片植入7天后的组织解剖照片
3 结论
针灸医学疗法作为我国传统的医学精髓不仅为我国也为世界做出巨大贡献。在传承祖国医学疗法的同时，还存在着一些不足，比如针灸器具消毒及使用方面的不完善。目前我国医院内和诊所仍然将针灸针具反复消毒及使用[16]，不能专人专用，一旦针灸针具消毒不完善、暴露空气中时间过长，或医务工作者无菌操作观念不强，都会造成院内交叉感染，给患者带来痛苦甚至增加新的健康隐患。
如果从材料本身出发，使其自身具备抑制细菌粘附和形成生物膜的能力，就会大大降低由于针灸针具消毒、使用不当造成的细菌感染风险。304型含铜不锈钢恰恰具备了这种特殊功能，其在保持普通304不锈钢原有性能的基础上，增添了抗菌性能，能够有效抑制细菌粘附及生物膜形成，可以作为一种新型针灸针具材料应用于医疗领域来降低患者遭受细菌侵袭的风险，从而有效减少患者感染的发生。
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本文编辑 苏欣
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Study on Antibacterial Performance of Copper-bearing Stainless Steel Used for Acupuncture Needles
SUN Zi-qing, REN Ling, YANG Ke
Institute of Metal Research, Chinese Academy of Sciences, Shenyang Liaoning 110016, China
Abstract：This article studied the antibacterial performance of a novel antimicrobial Cu-bearing Stainless Steel (304-Cu SS) through both in vitro and in vivo tests, which is expected to be applied in the field of medical acupuncture needles. The in vitro results showed that 304-Cu SS had better antimicrobial ability compared with 304 SS as the former had good bacterial effect in both escherichia coli and staphylococcus aureus. Meanwhile, 304-Cu SS could obviously inhibit the bacterial adhesion and the formation of bacterial biofilm. The animal test further proved that 304-Cu SS showed a great antiinfectious effect after implanted in muscle tissue of the New Zealand white rabbit. 304 Cu SS showed less number of bacteria on its surface as well as much lower infectious degree of tissue lesions around the implanting position in comparison with 304 SS. Thus 304-Cu SS has much potential to be used as an acupuncture needle material to reduce risk of patients from bacterial attack, and effectively restrain the bacterial infection caused by acupuncture needles.
Key words：copper-bearing stainless steel; antibacterial; acupuncture needles; bacterial biofilm; medical metal materials
[中图分类号]TG174.2；TG14
[文献标识码]A
doi：10.3969/j.issn.1674-1633.2017.01.002
[文章编号]1674-1633(2017)01-0007-03
收稿日期：2016-11-03
基金项目：国家自然科学基金重点项目（51631009）；国际自然科学基金面上项目（51371168）。
通讯作者：杨柯，研究员，博士生导师，研究领域包括新型医用金属材料、先进钢铁材料、储氢合金等。