在体测量大鼠缺血性脑损伤引起的脑组织电阻抗变化及组织形态学对照研究
宋佳丽1，杨琳1，亢君君2，李昊庭1，董秀珍1，付峰1
1.第四军医大学 生物医学工程系，西安 陕西 710032；2.第四军医大学 基础部，西安 陕西 710032
[摘 要]目的用电阻抗的变化趋势区分缺血脑卒中及其继发性脑水肿。方法 采用两电极法连续在体测量脑缺血大鼠脑组织的电阻抗，观察分析卒中后脑组织电阻抗随时间的变化规律，并用Image-Pro Plus分析微观形态学参数，作为脑卒中后电阻抗变化的对照和验证。结果大鼠脑组织在缺血6～8 h后，电阻抗达到峰值，与正常脑组织的电阻抗相比高10%～20%，随后大鼠缺血脑组织的电阻抗降低，同时缺血脑组织电阻抗的变化与微观形态学参数的变化有良好的相关性。结论大鼠缺血脑组织电阻抗随大鼠脑缺血时间的变化趋势表明，生物电阻抗测量技术有望用于区分缺血性脑卒中和卒中后的脑水肿。
[关键字]心脑血管疾病；缺血性脑卒中；脑水肿；生物电阻抗测量；微观形态学分析
引言
中国作为全世界脑卒中致死致残率最高的国家，每年有250万新发脑卒中患者，有140万人死于脑卒中[1-2]。脑卒中分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中占75%～90%[3]。脑卒中会引起继发性脑水肿，脑卒中和脑水肿的治疗方案不同，因此这两种脑损伤的诊断和区分、脑卒中的实时监测极为重要。现有的X-CT和MRI技术无法诊断早期的缺血性脑卒中、区分缺血性脑卒中和脑水肿、监测脑卒中。因此，临床上急需诊断监测脑卒中的新技术。
生物电阻抗测量技术是一种新型测量技术，早在1926 年Fricke H和 Morse S就提出将电阻抗测量技术用于乳腺癌的检测[4]，由于生物电阻抗测量技术具有无创、无辐射、廉价等优势[5]，这些优势吸引很多学者探索了生物电阻抗测量技术检测诊断颅脑损伤[6-8]、宫颈癌[9]、膀胱癌[10]、肺功能障碍[11]等疾病的途径。我们研究小组致力于研究生物电阻抗测量技术在颅脑损伤监测方面的应用，同时还有很多国内外研究小组致力于此方向的研究。
1972年，Fujita等将猫脑冷冻引起脑水肿，采用四电极法在体测量脑部电阻抗，脑损伤组织的阻抗值与正常脑相比下降了25%[12]。2002年，Lingwood等报道称缺氧引起小猪脑损伤后的6 h内脑部电阻抗增加，并证明电阻抗测量技术对脑水肿的敏感性比颅内压监测技术高[13]。2008年，Harting等在体测量外伤性脑损伤大鼠的脑组织的阻抗值，发现外部撞击损伤60 h后的大鼠的损伤脑组织相比于正常脑组织有明显的下降[14]。2013年，达特摩斯大学的Manwaring等在家猪的脑白质中注入新鲜血液，测得注血后的脑组织的电导率升高（19.5±11.5）mS/m[15]。2015年，Holder研究小组分别用两电极法和四电极法在体测量大鼠的正常脑组织和缺血脑组织的电阻抗，离体测量血块的电阻抗，发现在0～3 kHz的频率范围，缺血脑组织的阻抗值高于正常脑组织阻抗值[16]。这些研究明确地表明脑损伤的生物物理学变化会引起脑组织生物电阻抗的变化，因此，生物电阻抗测量技术有望成为诊断监测脑损伤的新技术。然而，不同研究小组模型制备方法不同，导致脑损伤的种类不同，其后形成继发性脑水肿的生物物理学机制也不同；再者，不同研究小组测量的时间点也不同，测得的电阻抗的变化规律都是脑损伤某个阶段的电阻抗的变化规律，由于从初期的脑损伤到其后的继发性脑水肿，脑组织的生物物理变化并不相同，宏观上自然表现出电阻抗变化的不同。这些不同导致目前研究结果的不一致，使生物阻抗测量技术距离颅脑疾病的临床监测还有一定差距，因此，探究脑损伤发展过程中电阻抗的变化趋势是生物电阻抗技术应用于颅脑损伤临床监测的必经之路。本研究试图利用脑组织在不同状态下阻抗值不同的特性，用生物电阻抗技术来诊断、区分缺血性脑卒中和脑水肿。
1 实验材料及方法
1.1 实验方案
1.1.1 动物准备
从第四军医大学实验动物中心领取体重为250～300 g的雄性大鼠22只，饲养温度为23～25°C，饲养时不控制大鼠的饮食。实验过程严格遵守动物伦理委员会的管理条例，所有动物实验方案经第四军医大学动物伦理委员会批准。
1.1.2 脑缺血动物模型制备
大鼠用10%水合氯醛（3.5 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧固定，颈正中线偏右1 mm切口1.5～2 cm，沿胸锁乳突肌方向分离右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），结扎CCA和ECA的近心端，在ICA近心端绕细线备用。在距离CCA分叉口1～2 mm处剪一个小口，将拴线插入到ICA中，插入深度为18 mm，梗阻右脑中动脉，然后用之前绕在ICA近心端的细线扎紧系牢，最后缝合伤口。
1.1.3 脑缺血动物模型验证、脑缺血体积及脑水肿程度测定从领取的22只大鼠中随机选取4只梗阻中动脉，分别在手术后2、6、10和12 h处死，取出新鲜脑组织，将其置于-20°C冰箱10 min后取出，在脑槽中切成约2 mm
厚的均匀脑组织切片。脑片放入1%TTC溶液中染色，在
37°C温箱中孵育20～30 min，缺血脑组织被染成白色，正常脑组织被染成红色。用高清照相机拍照，并用Image-Pro Plus软件计算缺血体积及脑水肿程度。参照文献[17-18]的计算公式：
其中，VIS为脑缺血体积，VIN为脑梗死体积，VL为左半脑的体积，VR为右半脑的体积，EBE为脑水肿的程度。1.1.4 电阻抗值的测量
从领取的大鼠中随机选取10只，其中7只梗阻右脑中动脉，并在大鼠右脑上方的颅骨打两个直径1 mm的小孔，不破坏硬脑膜，插入牙科钉并固定，将以Solartron1260电阻抗分析仪和1294生物电阻抗测量接口为核心的电阻抗频谱测量平台与牙科钉连接，采用两电极法连续测量大鼠右脑电阻抗12 h，测量频率为50 kHz，毎分钟一个点，作为实验组。其余3只大鼠麻醉后，不进行中动脉梗阻，直接在大鼠右脑上方颅骨打孔并以上述方法连续测量右脑电阻抗，作为对照组。
1.1.5 组织形态学对照
领取的大鼠中最后8只大鼠，将其中7只大鼠的右脑中动脉梗阻，分别在1、2、4、6、8、10和12 h后处死并灌注，然后取左右脑组织样本经石蜡包埋、切片（2～4 μm）、HE染色，在200倍光学显微镜下观察分析，并使用Image-Pro Plus软件提取微观形态学参数。剩下的1只大鼠不做任何处理，直接处死灌注，并用上述方法观察分析。
1.2 数据分析
数据以均值±标准差（mean±SD）的形式表示，用SPSS 14.0处理数据。
2 结果
2.1 动物模型验证结果
TTC染色结果，见图1，图中被染成红色的脑组织为正常脑组织，白色脑组织为缺血脑组织。因此，本研究使用的模型制作方法成功的使大鼠的右脑形成了局部缺血。
将图1中的各个图片分别用Image-Pro Plus软件处理，计算得到的缺血脑组织的体积分别为25.91%、15.54%、22.05%和53.76%。软件计算的脑水肿的程度如下：模型建立2、4、6和12 h后的缺血脑组织的体积，脑水肿的程度分别为6.39%、6.82%、8.49%和22.30%。
图1 大鼠脑缺血不同时段TTC染色结果
注：a.缺血2 h后；b.缺血4 h后；c.缺血6 h后；d.缺血12 h后。
2.2 电阻抗测量结果
测得的对照组3只大鼠的脑阻抗值，见图2，阻抗值都没有明显变化，阻抗值变化不超过5%。
图2 大鼠正常脑组织阻抗值随时间的变化
在体测得的实验组7只大鼠的脑阻抗值随时间的变化规律，见图3。图3显示了缺血脑组织的阻抗值先升高后降低，并在脑缺血6～8 h脑组织的阻抗值达到峰值，此时组织电阻抗相对于脑梗初期升高10%～15%。
图3 大鼠缺血脑组织阻抗值随时间的变化
2.3 微观形态对照结果
在200倍光学显微镜下观察脑组织的形态学结构，见图4，在中动脉梗阻2 h后，缺血缺氧造成神经细胞嗜酸性增强，同时水在细胞内的潴留导致细胞体积膨大；中动脉梗阻6 h后，血管内皮细胞与脑实质之间间隙增大，脑细胞染色质固缩，而且脑实质中水分增加；10 h后，血管的管腔闭塞，小胶质细胞逐渐增多，部分神经细胞坏死。
图4 大鼠缺血脑组织不同时段脑组织形态结构结果
注：a.正常脑组织；b.缺血2 h后；c.缺血6 h后；d.缺血10 h后。
细胞核个数和细胞面积随缺血时间的变化，见图5，在缺血2 h时，大鼠脑组织细胞个数减少，同时细胞面积增大；在缺血6 h时，在单位视野内大鼠脑组织细胞相对于缺血2 h的脑组织细胞个数几乎不变而细胞的体积增大；动物脑组织缺血10 h的细胞个数及细胞面积都有下降趋势。
图5 脑组织微观形态学指标：细胞核个数、细胞面积
3 讨论
在本研究中，动物模型的制作较成功，大鼠的右脑形成缺血区，并且脑水肿的程度也随时间递增。同时，本研究发现，大鼠脑缺血的12 h中大脑的电阻抗先升高后降低，在脑缺血6 h左右大脑的电阻抗达到峰值，比缺血初期高10%～15%。对照微观形态学的分析结果，缺血性脑卒中占主导地位时，脑组织的电阻抗呈现上升趋势；脑继发性脑水肿开始占据主导地位是，脑组织的电阻抗开始下降。
本研究在脑组织缺血6 h内脑损伤组织的阻抗值升高，与Lingwood等报道的缺氧后的6 h内脑组织的阻抗值持续升高一致[13]，但与达特摩斯大学的Manwaring等报道的在脑白质中注入新鲜血液后脑组织电导率升高有所出入[14]，可能是损伤模型不同，导致损伤组织的电阻抗变化趋势不同。D Holder研究小组动物模型与本研究相似[16]，测得的损伤早期电阻抗值的变化趋势也一致。
在本研究中，结果显示缺血后的大鼠脑组织的电阻率在12 h内呈现出先升高后降低的变化趋势，这种变化趋势的出现可能与缺血后脑组织的微观形态的变化有关。脑缺血初期损伤组织的电阻抗的升高，可能与脑组织中血流量的减少以及细胞体积的膨大有关，细胞的膨大导致细胞间隙的减小，使组织电阻抗升高[19]；当脑损伤进一步加重时，细胞外液中的水分虽然增加，但同时细胞间隙也在扩大，细胞间隙的增大使得在相同激励下经过组织的电流密度增大，导致组织电阻抗下降[19]。在脑损伤的发展过程中，当细胞间隙的增大占据主导地位时，脑组织的电阻抗值就会出现下降趋势；当脑损伤发展为重度脑损伤时，神经细胞坏死或破裂，细胞膜通透性增加[20]，组织的电阻抗可能会进一步下降。上述变化的示意图，见图6。脑缺血的前6 h，缺血性脑卒中占主导地位，脑组织的电阻抗呈现上升趋势；脑缺血8 h后，继发性脑水肿开始占据主导地位，导致脑组织电阻抗的下降。
图6 脑组织缺血后微观形态变化引起电阻抗变化的示意图
本研究初步探索了缺血性脑损伤在发生发展过程中，脑组织电阻抗值变化的规律。如果能在此研究的基础上进一步延长在体测量的时间，研究脑水肿发展过程中电阻抗的变化规律，可使研究更加完善。在本研究的基础上，可进一步探索其他类型的脑损伤（如出血性脑损伤）在发生发展过程中电阻抗值的变化规律，以及不同类型脑损伤的电阻抗变化之间的区别。这些研究结果可以作为电阻抗断层成像的基础，来诊断不同类型的脑损伤以及不同阶段的脑损伤。
4 结论
本研究用生物电阻抗测量技术和组织微观形态学对照的研究方法，证明了生物电阻抗测量技术可以用于区分缺血性脑卒中及其继发性脑水肿。本研究小组计划下一步研究出血性脑损伤的电阻抗变化规律，并通过电阻抗的变化区分缺血性脑损伤和出血性脑损伤。
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本文编辑 张丹妮
Electrical Impedance Variation Measurement of Rat Ischemic Brain Injuries and Tissue Morphology Control Study
SONG Jia-li1, YANG Lin1, KANG Jun-jun2, LI Hao-ting1, DONG Xiu-zhen1, FU Feng1
1. Faculty of Biomedical Engineering, Fourth Military Medial University, Xi’an Shaanxi 710032, China; 2. School of Basic Medical Sciences, Fourth Military Medial University, Xi’an Shaanxi 710032, China
Abstract：ObjectiveTo study the impedance variation of ischemic stroke and its’ secondary brain edema to distinguish the two types of brain injuries. Methods Two-electrode method was used to measure impedance of rats’ brain in vivo continuously. Then we analyzed the impedance variation over time, and the microscopic morphology parameters were analyzed by Image-Pro Plus as comparison and verification of the impedance variation.ResultsElectrical impedance of rat ischemic brain has risen 10%～20% after 6～8 h of brain ischemia, where the peak of the electrical impedance shows out. Then the impedance reduced over time. And there was a good correlation between the impedance variation and the microscopic morphology parameters.ConclusionBioelectrical impedance measurement technique can be used to distinguish ischemic stroke and secondary brain edema, as indicated by the impedance variation of rat ischemic brain over time.
Key words：cardiac-cerebral vascular disease; ischemic stroke; brain edema; bioelectrical impedance measurement; microscopic morphology analysis
[中图分类号]TM934.7；R743
[文献标识码]A
doi：10.3969/j.issn.1674-1633.2017.01.005
[文章编号]1674-1633(2017)01-0018-04
收稿日期：2016-10-09
修回日期：2016-11-09
基金项目：国家自然科学基金（51477176）；军队重大项目（AW S14C006）。
通讯作者：付峰，教授，主要研究方向为颅脑损伤的电阻抗成像研究。