专栏——公共卫生与人体健康信息监测-Part I
微流控芯片技术在公共卫生监测中的应用
蒋西然1a，章燕2，秦红梅2，冯智田2，于宁3，李文利1b，覃开蓉1a
1.大连理工大学 a.生物医学工程系；b.生命与医药学院，辽宁 大连 116024；2.辽宁省卫生计生委卫生计生监督局，辽宁 沈阳 110005；3.辽宁中医药大学第一临床学院，辽宁 沈阳 110032
编者按：随着经济的飞速发展，掠夺性资源开发造成的空气污染、土壤污染、水污染、沙漠化和生态失衡等问题，已直接威胁着人类自身的健康。对公共环境卫生和自身健康信息的监测是预防重大疾病、保障和促进人体健康的重要手段。在本专栏Part I系列文章中，主要介绍微流控芯片技术在公共卫生监测中的应用、基于肱动脉的中心动脉压力波无创检测仪研制、射频微功率雷达在智能睡眠管理中的应用、以及基于纹理特征的肝硬化MRI分期等，为公共环境卫生和人体健康信息监测提供一定的方法。
栏目主编：覃开蓉
覃开蓉，大连理工大学电信学部生物医学工程系教授，博士生导师。1991年获复旦大学学士学位，1996年获复旦大学博士学位，毕业后留校任教，先后任复旦大学讲师和副教授。2002～2004年在东京大学从事博士后研究。2005～2007年任上海交通大学力学生物学与医学工程研究所副教授。2007～2010年任新加坡国立大学电气与计算机工程系研究员。现为大连理工大学电子信息与电气工程学部生物医学工程系主任、中国自动化学会生物控制论与医学工程专业委员会委员、辽宁省医学信息与健康工程学会理事。近年来主要致力于力学、信息学与生物医学交叉融合的定量研究。主持或参加国家自然科学基金委、科技部、教育部项目10余项；在本领域的国内外主流期刊上发表论文70余篇；获省部级科技奖励2项；申报国家发明专利10余项。
[摘 要]微流控芯片具有微型化、集成化、自动化、灵敏度高和成本低廉的优势，适合于便携式现场检测的应用。与传统检测方法相比，微流控技术能够使检测时间从数天降低至数小时甚至数分钟，同时往往具有更高的灵敏度，特别有利于公共卫生执法人员在现场快速得到检测结果。因此，该技术有望成为新一代公共卫生监测领域的新的技术制高点，在国外已经有了很多应用，而在我国的发展水平仍较低。本文综合国内外发展现状，结合作者对该技术的研究经验，提出微流控芯片技术在我国公共卫生领域的研究现状、发展趋势和应用前景。
[关键词]微流控芯片；公共卫生监测；现场快检
在我国的公共卫生监测工作中，目前面临的一个难题是，执法人员在现场采集样品后，依据现有的技术无法快速得出结果，往往需要送到省会城市的实验室进行分析测试，不但需要耗时数天乃至数周，而且价格昂贵，不利于卫生执法工作的现场开展。因此亟需一种具有便携、快速和低成本特性的检测技术，能够在现场得出结果。微流控芯片正是一种能够将传统检测技术微缩化的平台，这些芯片的体积往往只有数平方厘米，重量约数十克，特别便于携带，而且对样本和试剂的需求量极低，因此在公共卫生领域的应用前景十分广阔。
1 微流控芯片技术
微流控芯片技术，或称芯片实验室（Lab on A Chip）和微机电技术（Micro Electro Mechanical System，MEMS），兴起于20世纪末期，并于21世纪初最早由方肇伦院士引入我国。微流控芯片技术集成了生物学、化学、医学、微机电和微加工技术，通过在聚二甲基硅氧烷（PDMS）、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、单晶硅和玻璃等材料上构建精密尺寸的微管道、阀门和腔室，由于芯片内部管道和腔室的尺寸通常在微米甚至纳米尺度，因此反应所需的样本量和试剂消耗量都极低（比常规检测方法降低数倍至数百倍），适合于对稀少样本的检测[1]。例如Fang等[2]构建的快速核酸分析芯片，能够在2 μL的反应体系中对样本进行快速扩增，试剂和样本的消耗量比常规方法降低了十倍。此外，微小体系中的流体具有很多新的特性，例如芯片内的化学反应速率往往比常规反应高一至两个数量级，很多常规方法需要数小时的反应，在芯片内部仅需数分钟或数秒钟[3]。Yuan等[4]构建的检测脑脊液中金黄葡萄球菌的微流控芯片系统，从样本处理到得出检测结果的时间缩短到60 min，能够在现场快速得出检测结果。相比于常规技术，微流控芯片的优势主要有：① 体积小。微型化的反应单元所需的试剂和样品消耗量很低，能够极大地降低成本；同时，微小的芯片便于携带，有利于现场检测的应用；② 集成化和自动化程度高。通过微加工技术，可以方便地在芯片内整合多个反应单元，从而有利于实现高通量并行检测。可见，如果能够将微流控芯片技术应用于公共卫生事业，就可以提高现场执法的效率，给予现场执法人员更高的自由度，同时，设备成本的大幅降低将使我国公共卫生工作的监测范围更广，利于实现在全国不同经济发展程度地区的大范围普及。
微流控芯片技术可以运用于诸多领域，不但能优化传统的分析检测技术，更体现了自身的独特潜力和巨大优势。但是该技术在我国的起步较晚，目前，基于该技术开发的微型便携式设备在医学诊断、卫生检测和环境监测等领域都刚刚崭露头角。
2 微流控芯片技术在空气传播性疾病快检中的应用
空气传播疾病具有传播速度快、范围广和难于监测的特点，一旦扩散很容易造成大范围污染，导致公众恐慌[5]。例如2003年爆发的非典及近年的禽流感疫情，都因为缺乏有效的快速检测手段，而无法对空气病原菌的传播方位进行及时快速的监控。传统的空气微生物检测技术主要有落板培养法和安德森采样器法，原理均是将空气中的微生物收集在平板培养基上进行培养，再通过显微镜镜检进行分析[6]。这些传统方法的严重缺陷是：① 自然界绝大多数微生物尚无法培养，可培养的微生物只占总数的不到1%[7]，因此可检测出的微生物种类极为有限；② 即便能够培养生长，从空气样本采集到得出检测报告，也往往需要数天到一周的时间，无法满足实时快速的检测需要。正因为此，对空气传播疾病的监测和早期预防始终是一个世界性难题，同时也是我国空气卫生监测工作面临的重要挑战。
本实验室针对这一问题进行了深入研究，并构建了世界首个能够快速捕获、富集和检测空气中的病原微生物的微流控芯片系统。该系统含有一种特殊的鱼骨状结构，当空气在这种结构的上方流过时，空气中的微生物能被截留下来并保存在芯片的管道内。而后，利用微小体系的洗脱液对捕获到的微生物进行洗脱富集，就可以很方便地得到高浓度的空气微生物富集液，以便进行下游分子生物学分析。2012年，本实验室构建了含有芯片PCR快速扩增模块的分析系统，并以空气气溶胶中的大肠杆菌、金黄葡萄球菌和肺炎克莱伯杆菌等为检测对象，对系统进行了可靠性验证。该芯片可以在3个小时内实现从空气微生物的采集到PCR扩增完成，所需试剂消耗仅为传统方法的十分之一。整个系统可由电池供电，体积很小携带，适合于在野外或公共场所进行针对空气病原微生物的快速检测[1]。自2003年SARS疫情之后，人们对呼吸道病原体的快速筛查鉴定技术提出了更高的要求。已知的呼吸道病原体已超过二十余种，利用传统的PCR技术只能对病原体样本进行逐一扩增，费时费力，显然无法满足疫情控制和突发公共卫生事件应急处置的需要。为了解决这个问题，笔者于2013年分别构建了含有高通量微柱式酶联免疫测定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）模块[8]和高通量恒温核酸扩增（Loopmediated Isothermal Amplification of DNA，LAMP）模块[4]的分析系统，其原理是巧妙地在微流控芯片内部设计了大规模并行式微反应单元，可以实现在一次实验中，针对同一样本进行多种不同指标的并行式检测反应。2014年，通过进一步使用这种微流控芯片系统在山东省省立医院对人流量密集的门诊大厅、急诊病房和公共走廊等地进行了空气中金黄色葡萄球菌的检测分析，这是世界上首次进行此类研究。该研究成果尚未发表，但此项研究成果为公共场所空气病原微生物的快速检测提供了一种全新的技术平台，利用这种微流控芯片技术，有望构建对空气气溶胶所含多种传染性病原微生物进行高通量、全自动的在线实时监测的分析系统。
3 微流控芯片技术在微生物现场快检中的应用
在人群密集的公共场所，很多传染性疾病具有较强的隐蔽性，危害较大。对于我国公共卫生监测部门来说，能够快速检测出这些病原微生物，并向公众提出流行性疾病的预警信息，是极为重要的一项工作内容。但是，受限到传统检测技术的限制，目前尚缺乏对公共场所病原微生物的快速检测方法，监测结果缺乏时效性。尤其是在偏远地区，此类快速检测更是难以开展。为了解决这个问题，当前的一个研究方向是将微流控芯片技术与LAMP技术相结合。LAMP技术是一种在恒温条件下进行核酸分子扩增的新技术，具有较高的灵敏度，而且所得到的结果肉眼可见。在微流控芯片内部进行微小体系的LAMP核酸扩增反应，不但对样品的需求量极低（通常为微升或纳升），而且往往可以在一个小时内完成从样品的采集到检测结果的得出，速度快、消耗低，可以满足现场快速检测的需要[4]。例如复旦大学方雪恩博士构建的一种数平方厘米大小的微反应芯片，可以同时对3种不同亚型的大肠杆菌进行快速检测，这些芯片造价低廉，便于携带，而且无需复杂的设备读取结果[9]。本实验室前期开发的一种能够快速检测病原微生物的芯片设备，能够对医院等公共场所采集的样本进行快速分析，从采样到得出检测结果总耗时约1 h，同时，芯片反应体系只需约1.5 μL的试剂消耗量，而芯片本身的造价也仅为十余元，在成本上具有很大优势。该系统在针对标准菌株和临床样本的检测实验中，均获得了特异性较高的结果，稳定性较好[4]。这种便携性强、操作简单而且结果肉眼可见的微流控芯片，对于偏远山区或灾区的现场卫生监测，以及战场或生物反恐所需的快速检测，都有重要的应用价值。
另外，微流控芯片具有易于跟其它技术相整合的特性，例如Stedtfeld等[10]将微流控检测芯片与智能手机联用，能够将芯片上获得的光学信号输入手机，并利用手机软件进行运算分析，这就特别适合于卫生执法人员在现场快速检测，也有利于实现公众直接参与公共卫生监察，有利于提高公民卫生意识。而Lilehoj等[11]在此基础上进一步开发的芯片系统，是通过特异性抗体实现对疟原虫的特异性识别和捕获，并将产生的微弱的电信号传导至手机中，再利用手机的智能软件进行深入分析处理。Navruz等[12]则将微流控芯片与智能手机的摄像头相连接，构建了便携型显微呈象系统，能够对物体表面的病原微生物进行实时呈象分析。这些最新的研究进展，都是利用微流控芯片的便携性，针对现场实时检测的尝试。值得一提的是，近年在我国兴起的“健康云”的概念，也是利用手机等便携式终端将现场数据通过网络上传的中心实验室服务器，并在实验室得出更精密的检测结论后再发送给用户，这种云网络的基础依赖于一种微型且快速高效的生物医学检测端，而微流控芯片技术恰好可以满足这种需求，不但可以替代昂贵的仪器设备，而且具有更高的检测灵敏度，更有利于简化繁琐的操作步骤。在公共卫生监测领域，如果也能建立起类似的云系统，就便于一线执法人员快速得到检测结果，从而促进卫生监察工作的快速和科学开展。
4 微流控芯片技术在水体微生物监测中的应用
水是病原微生物传播的主要媒介之一，世界各地由于病原生物污染水源而引发的大规模疾病暴发事件屡见不鲜，而发展中国家更是有数亿人的生活用水得不到安全保障。水质监管部门除了要对水中有毒有害化合物和重金属进行监测外，还要兼顾对水中病原微生物的检测。而在水体微生物检测中，受限于已有的检测分析技术，往往需要将样品采集、病原体富集、病原体分离纯化以及病原微生物鉴定等工作分时分地完成，工作效率很低[13]。为此，世界多国政府将目光投向了微流控芯片技术。本实验室前期构建的一种结构简单的微流控芯片，能够在20 min内检测水体中的阿米巴虫，所需样本量仅为2 μL[14]。而通过在芯片内部整合生物免疫磁珠或电化学等技术，则可以高效完成对于水中一种或多种特定微生物的富集工作。例如Guan等[15]采用芯片免疫磁珠分离法对水中大肠杆菌富集率可达92%～96%。而利用微流控芯片的特殊结构，则能够在富集蓝贾第鞭毛虫卵囊和隐孢子虫孢囊的同时，将它们按照尺寸大小的不同分选出来[16]。采用微流控技术完成富集工作的另一个优势在于，通过在芯片内整合检测模块，就可以将下游检测所需的固定和染色等步骤全部整合到一块芯片上完成，再通过配合使用便携式光学检测系统，就能方便地实现对样品中寄生虫卵的信息进行快速获取，特别是对于寄生虫孢囊或卵囊的检测技术已经较为成熟。富集到的细菌或病毒可以直接在芯片上完成从细胞裂解到核酸提取、扩增和产物鉴定等全部工作流程，从而在基因水平上完成对病原微生物的精确鉴定。
目前，基于微流控芯片开发的检测设备对大肠杆菌和隐孢子虫等病原微生物的检测极限可以达到单个细胞的水平，这得益于在微流控芯片内部构建的微型单细胞捕获和实时检测模块，并可以很方便地实现精确定量[17]。将微流控技术与光学系统和电子设备整合一体，以实现自动化分析也是当下一个重要的研究方向[18]。另外，对于前期水样采集和预处理环节的技术革新与优化同样影响着微流控技术在水质监测领域的发展。可以预见，基于微流控芯片的分析设备将极大降低水质监测的成本，提高水检部门的工作效率，提高偏远地区的水体微生物监测水平。
5 展望
微流控芯片技术兴起的时间较短。但近年来该技术在发达国家已经受到了极大的关注。尤其是2006年Nature杂志长篇幅详细报道了微流控芯片的发展，并将其评价为“这一世纪的技术”[19]以后，微流控芯片逐渐成为了涵盖生物、化学和医学等诸多领域的新的技术制高点，但遗憾的是在我国的研究较少，距离实际应用还有很长的路要走。微流控芯片技术在我国公共卫生监测，尤其是现场快检领域的应用前景十分广阔，在不久的将来甚至有望引领一场微型医学检测技术的革命。
[参考文献]
[1] Jiang XR,Jing WW,Zheng LL,et al.A Continuous-flow highthroughput microfluidic device for airborne bacteria PCR detection[J].Lab Chip,2014,14:671-676.
[2] Fang XE,Chen H,Yu SN,et al.Predicting Viruses Accurately by a Multiplex Microfluidic Loop-Mediated Isothermal Amplification Chip[J].Anal Chem,2011,83:690-695.
[3] Zhang YH,Ozdemir P.Microfluidic DNA amplification - A review[J].Anal Chim Acta,2009,638:115-125.
[4] Yuan H,Liu YC,Jiang XR,et al.Microfluidic chip for rapid analysis of cerebrospinal fluid infected withStaphylococcus aureus[J].Anal Methods,2014,6:2015-2019
[5] 傅本重,赵洪波,永保聪,等.公共场所空气微生物研究进展[J].中国公共卫生,2012,6(28):857-858.
[6] 周雪媚,李玉光,刘国军,等.殡仪场所空气微生物污染分析[J].中国公共卫生,2010,8(26):1054.
[7] Jing WW,Zhao W,Liu SX,et al.Microfluidic Device for Efficient Airborne Bacteria Capture and Enrichment[J].Anal Chem,2013,85:5255-5262.
[8] Jing WW,Jiang XR,Zhao W,et al.Microfluidic Platform for Direct Capture and Analysis of AirborneMycobacterium tuberculosis[J].Anal Chem,2014,86:5815-5821.
[9] Fang XE,Chen H,Xu LJ,et al.A portable and integrated nucleic acid amplification microfluidic chip for identifying bacteria[J].Lab Chip,2012,12:1495-1499.
[10] Stedtfeld RD,Tourlousse DM,Seyrig G,et al.Gene-Z: a device for point of care genetic testing using a smartphone[J].Lab Chip,2012,12(8):1454-1462.
[11] Lilehoj PB,Huang MC,Truong N,et al.Rapid electrochemical detection on a mobile phone[J].Lab Chip,2013,13(15):2950-2955.
[12] Navruz I,Coskun AF,Wong J,et al.Smart-phone based computational microscopy using multi-frame contact imaging on a fiber-optic array[J].Lab Chip,2013,13(20):4015-4023.
[13] Seitz SR,Leon JS,Schwab KJ,et al.Norovirus infectivity in humans and persistence in water[J].Appl Environ Microbiol,2011, 77:6884-6888.
[14] Zhao W,Zhang L,Jing W,et al.An integrated microfluidic device for rapid serodiagnosis of amebiasis[J].Biomicrofluidics,2013, 7(1):011101.
[15] Guan X,Zhang H,Bi Y,et al.Rapid detection of pathogens using antibody-coated microbeads with bioluminescence in microfluidic chips[J].Biomed Microdevices,2012,12:683-691.
[16] Kim J,Erath J,Rodriguez A,et al.A high-efficiency microfluidic device for size-selective trapping and sorting[J].Lab Chip,2014, 7:2480-2490.
[17] White AK,Vanlnsberghe M,Petriv OI,et al.High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR[J].PNAS,2011,108(34):13999-14004.
[18] Bridle H,Miller B,Desmulliez MP.Application of microfluidics in waterborne pathogen monitoring: A review[J].Water Res,2014, 55:265-271.
[19] Whitesides GM.The origins and the future of microfluidics[J].Nature,2006,442:368-373.
Microfluidics and Its Application in Public Health Monitoring
JIANG Xi-ran1a, ZHANG Yan2, QIN Hong-mei2, FENG Zhi-tian2, YU Ning3, LI Wen-li1b, QIN Kai-rong1a
1. a. Department of Biomedical Engineering; b. School of Life Science and Medicine, Dalian University of Technology, Dalian Liaoning 116024, China; 2. Liaoning Health and Family Planning Inspection, Health and Family Planning Commission of Liaoning Province, Shenyang Liaoning 110005, China; 3. the First Clinical College, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang Liaoning 110032, China
Abstract：Microfluidic technology provides advantages like miniaturization, integration and automation, as well as high sensitivity and low cost, which makes it suitable for point-of-care detections. Comparing with traditional methods, the detection time decreases from days to hours or minutes with lower detection of limit, making the technology helpful for the public health supervisors to obtain analytical results rapidly in field. Thus, the microfluidics is a great potential technique in public health inspection and has been widely used in modern countries, while rarely utilized in China. Herein, in combination of the author’s experience in research of the microfluidic technology, this paper reviewed its research progress, development trend and future applications in consideration of its current research status quo in China.
Key words：microfluidics; public health monitoring; point-of-care detection
[中图分类号]R446
[文献标志码]A
doi：10.3969/j.issn.1674-1633.2016.08.002
[文章编号]1674-1633(2016)08-0005-04
收稿日期：2016-07-25
基金项目：国家自然科学基金项目（81501833）；辽宁省自然科学基金（2015020574）；上海市大气颗粒物污染防治重点实验室开放课题基金（FDLAP15003）。
通讯作者：邮箱：krqin@dlut.edu.cn