一种小型集成化的荧光免疫分析仪的研究和开发
何文兵1，刘先成2，周明2，杨力1
1.重庆大学 生物工程学院，重庆400044；2.深圳普门科技有限公司，广东 深圳 518055
[摘 要]为满足便携式移动即时检测和快速诊断，本文设计了集孵育、打印、人机交互操作等功能于一体的小型便携式荧光免疫分析仪，分别对孵育和检测模块进行结构设计和功能实现，并对整机系统进行测试和验证分析，结果证明本文研制的荧光免疫分析仪具备较高的灵敏度、重复性和准确性，既可应用于医院临床检测，也适用于院外其他场合（如家庭医疗、野外营救等）。
[关键词]荧光免疫分析仪；集成化；临床检测
荧光免疫分析技术是一种新型的超微量免疫标记分析方法[1]，它继承并结合了荧光免疫分析技术和免疫层析技术的检测方法。荧光免疫分析技术具备检测灵敏度高、对环境无污染、无放射性、操作简单等优点[2]，已被广泛应用于多个领域，其中较为突出的在医学检测方面，且已成功研制出多种临床检测试剂。为满足市场需求和应用要求，本文研究并开发出一款适用于临床快速即时检测，同时操作方便的医学检验仪，以减少患者的等待时间，提高检验人员的工作效率。
1 系统方案设计
为实现荧光免疫分析仪的小型化和集成化，整机的设计思维采用多功能模块化设计，模块化的开发方式符合高效快速发展的需求，可满足产品多功能灵活多变。根据系统要求设计出整机方案框图，见图1。
图1 荧光免疫分析仪方案设计框图
根据系统方案设计，在小型化的荧光免疫分析仪中实现了高度集成化：人机交互操作—抗原抗体的免疫反应—分析检测—打印检测报告，简化了检验人员的操作步骤，且其内部配置了可充电式电池，提高了分析仪的适用范围。
2 孵育模块设计和实现
2.1 孵育模块设计
大型全自动的医学检验仪器中，抗原抗体的免疫反应均设置于机内。然而，为实现仪器的集成化、便携式和操作方便，本研究将抗原抗体的免疫复合反应集成于机内。
孵育模块模型示意图，见图2。
为保证免疫反应的恒温反应环境，在孵育模块中设计了一个特定功率的加热膜，并通过特殊的保温材料将孵育存储器密封，有效地维持了孵育环境的温度。孵育存储器中分别设置了温度传感器、保护开关和样本检测光耦。
2.2 孵育模块实现
为保证抗原抗体免疫复合反应的一致性，需要将孵育模块维持在某一恒温环境。研究表明，孵育恒温模式的设定值一般为37 ℃[3]。然而，孵育温度变化是一个非线性、复杂的过程，并且采用传统的模拟电路控制很难实现较理想的孵育温控效果。为保证孵育模块温度基本维持恒定不变，本文采用了模糊自适应PID控制算法[4]进行温度控制，
其算法控制框图，见图3。
根据控制算法，对孵育模块进行温度监测，得出孵育模块温度曲线，见图4。
图2 孵育模块模型示意图
注：1.保温棉；2.孵育存储器；3.加热膜；4.加热膜压片；5.螺钉；6.光耦检测板；7.保护开关；8.温度传感器。
图3 模糊自适应PID控制图
图4 孵育模块温度曲线
从监测得到的温度变化曲线可知，当孵育模块达到恒温模式后，孵育存储器的温度基本恒定不变，波动非常微小，即该温度控制算法对孵育储存器进行恒温模式控制，取得了较好的控制效果。
3 检测模块设计和实现
荧光信号的检测是荧光免疫分析仪的核心，检测模块的设计是仪器设计的重点。本研究的检测模块采用了非共聚焦型的动与静相结合的双光源荧光信号检测模块，即自由机械运动，固定扫描光路。其机械传动部分采用直线电机来实现，即电机的转动通过丝杆和螺母的配合转化为直线运动，从而实现试剂卡在水平方向上的运动。其双光源光学光路的设计，见图5。
图5 双光源光学光路示意图
注：1.光电检测器；2.紫外LED；3.凸透镜；4.滤光片；5.光栅；6.待测样本。
根据共聚焦型的检测原理可知，本文设计的双光源模型，其光源位置应布置于与试剂卡水平面45°夹角处[1]。同时，为提高荧光信号检测的准确性和灵敏度[5-8]，进行了如下设计：
（1）为实现小型化，选用了发光效率高、波长和功率稳定的紫外LED作为激发光光源，相比于传统的光源（如氙灯）有体积小、结构简单、易于实现、寿命长等优点。
（2）小孔光栅，在接收光路中将荧光汇聚到光电检测器的敏感区，提高了光电检测器检测的灵敏度。
（3）为避免其他背景光和杂散光的干扰，根据荧光标记物所发射的荧光特性，选择了613 nm波长的滤光片，有效地提高检测结果的准确性。
4 仪器测试验证
4.1 最低检测限度
本文将10 mg/mL的荧光微球标准品按照100倍比例进行多次稀释，分别得到100 μg/mL、1 μg/mL、10 ng/mL、1 ng/mL四种不同浓度的标准品溶液，将四种不同浓度的溶液分别用全自动Bio-dot喷样在试纸条上，并做出不同浓度的标准试剂卡，采用本文设计的仪器进行检测，得到荧光信号强度值，见表1。
表1 不同浓度荧光微球标准品测得的信号值
由此说明，本文研制的荧光免疫分析仪的检测浓度可达到pg/mL级。仪器检测系统的检测灵敏度较高，可适合不同检验项目的不同检验范围要求。
4.2 重复性检测
4.2.1 单机重复性
众所周知，只要仪器对相对较低浓度的样品具有较好的重复性，对相对较高浓度的样品必然具有较好的重复性。本文选取10 ng/mL和100 μg/mL的试剂卡进行重复性验证，将两种不同浓度的试剂卡在相同条件下进行多次重复测试，得到的荧光信号强度值，见表2。
表2 仪器重复性测试验证
由此说明，本文设计的仪器在高浓度样品检测方面具有较好的重复性，而在较低浓度检测方面重复性相对偏差。
4.2.2 仪器间重复性
为验证仪器与仪器之间的一致性，本研究选用8台仪器，对浓度为10 ng/mL的标准品溶液在相同条件下进行多次重复测试，得到的荧光信号强度值，见表3。
表3 仪器与仪器间重复性测试验证
根据仪器与仪器间的测试数据得出，仪器之间具有较好的一致性。
4.3 临床样本
验证完仪器性能后，为测试荧光免疫分析仪是否能满足临床检测，与具有代表性的Roche电化学发光作比对测试，测试数据，见表4。
表4 临床测试对比
注：样本来源深圳市第三人民医院。
通过对比发现，此荧光免疫分析检测结果与Roche检测结果间的误差＜10%，即符合临床检测。
5 结论
本文研究并开发了一款小型的集成化荧光免疫分析仪。该荧光免疫分析仪具备以下特点：① 仪器内部集成了微型打印机、人机交互、检测模块以及抗原抗体复合免疫反应的孵育模块，并配置了可充电的锂电池；② 采用了模糊自适应PID恒温模式控制，有效控制了孵育存储器的温度波动，为待测样本的荧光检测提供了保障；③ 采用了非共聚焦型的动与静相结合的双光源检测模块，且选用紫外LED作为激发光光源；④ 在实现激发和荧光检测的同时，检测模块结构紧凑、光学光路结构简单化，降低了生产制造成本，更具有产业化的可行性。
通过测试和验证得出，本文研制的荧光免疫分析仪具有较高的检测灵敏度和较好的重复性，且可满足临床检测。基于本文的研究成果，可研究并开发出更具自动化、更多孵育通道和多检测通道同时检测的免疫产品，实现全自动快速检测。
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Research and Development of a Compact and Integrated Fluorescence Immunoassay Analyzer
HE Wen-bing1, LIU Xian-cheng2, ZHOU Ming2, YANG Li1
1. Department of Biological Engineering, Chongqing University, Chongqing 400044, China; 2. Shenzhen Lifotronic Technology Co., Ltd., Shenzhen Guangdong 518055, China
Abstract：To meet the requirements of portable and instant detection of diseases and rapid diagnosis, this paper designed a compact portable fuorescence immunoassay analyzer that could be used for incubation, print, human interaction, andetc. The paper analyzed the incubation and detection module respectively and examined the process of function realization. Then testing and validating analysis were conducted on the whole system. The immunoassay analyzer developed by this research was characterized by high sensitivity, reproducibility, and accuracy. The fuorescence immunoassay analyzer can not only be applied to clinical testing, but also be used for the other occasions outside the hospital, such as home health care and rescueetc.
Key words：fuorescence immunoassay analyzers; integration; clinical testing
[中图分类号]R446.6
[文献标志码]A
doi：10.3969/j.issn.1674-1633.2016.07.009
[文章编号]1674-1633(2016)07-0030-03
收稿日期：2016-01-19
基金项目：深圳市海外高层次人才创新创业资金（KQTD20140630 10175739）；国家“111”计划项目（B06023）；国家自然科学基金（30870608，11532004）。
通讯作者：杨力，教授，重庆大学生物工程学院院长，主要从事医学工程与医疗器械方面的研究。