呼气检测肺癌的临床应用林丽泉，王福园，陈星 浙江大学 生物医学工程与仪器科学学院，浙江 杭州 310027 [摘 要]肺癌是目前世界上最常见也是死亡率最高的癌症，而大多数肺癌患者往往是到了中晚期才被确诊，因而错过最佳治疗阶段。研究表明肺癌的早期诊断结合及时治疗能有效延长患者5年的生存期，因此迫切需要有效的早期诊断方法。目前临床普遍采用低剂量CT扫描、X线检测等手段检测早期肺癌，但是由于其辐射危害，会增加患癌风险。呼气检测作为快速无损的诊断方法之一，在早期肺癌诊断中是一种极具发展前景的技术手段，有着十分明确的临床应用价值。 [关键词]呼气检测；肺癌诊断；挥发性有机物；冷凝物 1 研究背景肺癌是目前世界上最常见也是死亡率最高的癌症[1]，而大多数肺癌患者往往是到了中晚期才被确诊，因而错过最佳治疗阶段。研究表明肺癌的早期诊断结合及时治疗能有效提高患者5年生存率[2]，因此迫切需求有效的早期诊断方法。目前临床用于早期检测肺癌普遍采用的是低剂量CT扫描[3]、X线检测[4]等。虽然这些方法确实有助于早期肺癌的发现，但是即使是短暂的暴露在放射线下，仍然会增加其患癌风险。作为快速无损的诊断方法，呼气检测在早期肺癌诊断中是一种极具发展前景的技术手段，有着十分明确的临床应用价值。 呼吸气体诊断是检测呼出气体中成分的改变，来反映组织细胞新陈代谢的改变，从而评估健康状态以及疾病类型。肺作为呼吸作用的主要器官，一旦其出现病变，呼出气体中会含有相对浓度较高的肺部疾病标识物。呼吸气体检测肺癌的第一步就是需要找到针对肺癌的呼出气体中的标志物，目前国际上还没有公认的肺癌标志物，但各项研究仍然层出不穷。本文主要介绍目前呼气检测肺癌的标志物研究以及未来的发展趋势。 2 肺癌呼气标志物的研究呼气肺癌标志物主要分为两部分，一是挥发性有机化合物，另一部分是非挥发性有机化合物；前者在室温下主要以气体状态存在，其中绝大部分是挥发性有机化合物（Volatileorganic Compounds，VOC），后者为呼出气体冷凝物（Exhaled Breath Condensate，EBC）主要在液体状态下存在，其中包含有蛋白和基因等物质。 2.1 VOCs中的标志物在临床的应用 VOC指的是常温下以蒸汽形式存在，其沸点50～260℃之间且室温饱和蒸汽压超过133.32 Pa的有机物。人体呼出气中的VOCs只有ppd-ppt数量级的含量，但种类众多，成分复杂。肺部的一些病变可能导致相比于正常情况下的VOCs种类或者浓度的变化，监测VOCs的组成成分和水平可以有效的用于肺癌的早期诊断、筛选、预后等方面的临床应用。虽然目前没有公认的标志物，但是研究者们不断的发现呼出气中的肺癌标志VOCs。其中主要包括7大类烷烃类、醇、醛、酮、酯、腈、芳香族化合物[5]。可是，关于呼出气体与肺癌之间的关系尚不明确，学者认为烷烃类物质，比如乙烷、戊烷等是由细胞膜上的不饱和脂肪酸的脂质过氧化反应的产物。 Gordon等[6]最早利用GC-MS检测技术分析了12个肺癌呼出气样本和17个健康人呼出气样本，并在其质谱图上选择了2组差异最大的22个物质峰进行分析，同时建立模型来区分肺癌与非肺癌。通过这个实验，证明了呼出气有临床诊断肺癌的价值。 Phillips等[7]同样采用GC-MS的检测方法前后做了几次实验：1999年，采集检测了108例胸片异常的（其中60例经由组织学检查为肺癌）病人的呼出气，并找到22种VOCs的组合用于诊断肺癌，达到了71.7%的诊断灵敏性和66.7%的诊断特异性，并且这个组合对肺癌I期有100%的敏感性和81.3%的特异性；2003年，收集了178例支气管镜检查的病人和41个健康的志愿者的呼出气对原发性肺癌（Primary Liver Cancer，PLC）的诊断进行研究[2]，建立了由9种VOCs组成的预测模型，该模型对PLC的敏感性为89.6%、特异性为82.9%，可用于在肺癌高危人群中进行肺癌的筛选；2007年，采集了193位肺癌患者和211位健康人进行呼吸检测，又确定了16种有特异性差异的VOCs[8]。Phillips的研究结果中VOC包含烷烃类、醛、芳香族化合物等物质。同时，Poli等[9]采用SPME-GCMS分析了非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC）、慢性阻塞性肺病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）、吸烟组、对照组4组人的呼出气，发现的13种VOCs的组合能有效的区分这些组别。此外还发现，异戊二烯和癸烷含量在手术后会显著降低，这代表VOCs的确对肺癌预后有潜在的临床应用价值。 除了GC-MS检测手段的应用，还有其它检测方法被用于呼出气检测肺癌的研究。Wehinger等[10]采用质子转移反应质谱（Proton Transfer Reaction Mass，PTR-MS），并发现质荷比为31和43的VOC可以区分原发性肺癌和健康对照组。该实验还说明了更省时和更方便的呼气检测肺癌技术未来在临床应用上会有很大的发挥空间。 以上都是介绍各项区分肺癌与非肺癌之间的VOCs种类的研究，目的在于寻找标志性VOCs来进行肺癌的早期诊断、筛选、预后等临床应用。本课题组从患肺癌风险的方向进行了探究，为VOCs能在高危人群中筛选出相对更高危的对象提供证据。由于目前医学上对肺癌高危人群的界定是根据吸烟年限，吸烟量等一些外在风险因素的衡量来实现的，对于这部分人进行后续的CT或者X线筛查会增加这部分人群暴露在辐射下的机率而增加其患癌风险。呼气检测的这一临床应用，主要表现在其提供了生物证据来更为精确的认定高危人群。笔者采集了155例体检病人的呼出气，同时采集环境气体。气体被富集在Tenax填充的金属管中，然后利用热脱附仪进行脱附，使用GC-MS技术进行物质分析。运用统计学分析，并发现了一些VOCs能区分吸烟状态、吸烟年限、吸烟量等吸烟情况。而且其中有些VOCs曾在各项研究中报道为肺癌标志物。这些VOCs显然为更好的筛选肺癌高危人群以及患癌风险评估提供了生物学依据，具有巨大的临床应用价值。 2.2 EBC中的标志物在临床上的应用 目前在EBC中发现的与肺癌相关的主要标志物有以下几类：p53等基因类物质、MicroRNA、细胞因子、酶类物质、血管生成因子及其它功能蛋白。 Carpagnano等[12]首次报道了通过检测EBC能诊断肺癌，因其在EBC中检测到了炎症标志物：细胞因子——白介素-6（IL-6）[11]、血管生成因子——内皮素-1，且在EBC样本中这两种物质在NSCLC组中的浓度高于对照组样本中的浓度（P＜0.05）。Gessner等[13]又检测了74个EBC的样本，发现了血管生成标记物（VEGF、bFGF、血管生成因子）、白介素8（IL-8）、肿瘤坏死因子（TNF-α）可作为肺癌标识物。其中EBC中的血管生成标记物能显著的区分17个NSCLC患者、稳定或加剧的COPD患者以及健康志愿者。 Zou等[14]收集了105个肺癌病人和56个健康人的EBC样本，采用化学发光免疫测定的检测方法在EBC中检测到了癌胚抗原（Carcino-Embryonic Antigen，CEA）、鳞状细胞癌抗原（Squamous Cell Carcinoma，SCC）、神经元特异性烯醇酶（Neuron-Specific Enolase，NSE）。这几种蛋白在临床上通过检测血清中的含量而作为标志物应用于肺癌检测中。在该研究中，同时检测血清中的3种蛋白的含量并与EBC的检测结果进行对比。结果发现，EBC中检测到的蛋白比血清中检测到的有更高的阳性率以及组织学类型的特异性。此外，EBC中的CEA还显示出很好的预测早期NSCLC的特性（P＜0.006）。实验不仅证明了EBC中的物质的确存在临床诊断肺癌的应用价值，更说明了EBC中的肿瘤标记可能会比血清中的肿瘤标识物表现出更有效的肺癌诊断。 基因类的标志物同样在EBC中被发现，Carpagnano等[15]在采集分析了41例NSCLC患者和18例非肺癌的EBC样本中发现了3p微卫星改变（Microsatellite Alterations，MAs），揭示了NSCLC的EBC中发现的DNA微卫星比对照组更频繁，且微卫星的序列能够对应每个NSCLC患者的肺癌组织。随后，该研究组又对34例NSCLC患者和33例健康人（包括19个非吸烟人和14个吸烟的人）的EBC中的19q区进行微卫星检测分析[16]，发现对于非吸烟的健康组来说不管在EBC中还是在全血中都没有发现微卫星改变，而有16%的健康吸烟组以及25%的NSCLC患者的EBC中检测到微卫星的改变。该研究表明19q区的微卫星改变为EBC中的DNA微卫星改变作为遗传物质提供了依据，同时证明了核苷酸切除修复交叉互补基因-1（ERCC-1）、核苷酸切除修复交叉互补基因-2（ERCC-2）的微卫星改变对NSCLC的诊断具有特异性。阐明了EBC中19q区的微卫星改变可用于NSCLC的诊断、预后等临床应用。 此外，Gessner等[17]在EBC中检测到p53基因突变，且NSCLC患者的EBC中的p53基因突变明显高于对照组的情况。该研究结果还阐述了EBC中的基因突变可用于研究直接和烟草相关的DNA损伤。Han的研究组[18]在EBC中发现了DNA甲基化，通过对比分析，发现肺癌吸烟组Ras凋亡家族基因1A的甲基化密度比对照组高，且肺癌组中戒烟者的甲基化密度高于非吸烟者和吸烟者，而非肺癌组中的甲基化与吸烟情况无甚相关。由此推断EBC中的DNA甲基化与吸烟情况和肺癌有一定关系，可为患癌风险评估提供生物学依据。 MicroRNA（miRNA）是一类由内源基因编码的长度约为18-25个核苷酸的非编码单链RNA 分子，在细胞的表观遗传控制流程中具有重要作用，能具体地绑定到目标信使RNA（mRNA）序列。MicroRNA的表达变化与多种疾病相关，研究人员也着手研究其于肺癌的相关性。在EBC中发现MicroRNA后，Mozzoni等[19]分别分析了54例NSCLC的EBC样本、血清样本和46例对照组的两种样本。结果发现，miRNA-21不管是在EBC中还是在血清中肺癌组的表达都高于对照组，而miRNA-486恰恰相反，肺癌组中的表达低于对照组，这样的表达区别对提高诊断率有很大的临床意义，在未来的肺癌高危人群筛选中也占有重要作用。 3 未来趋势临床上一般需要多个诊断指标联合分析的方法对一个疾病进行综合判断。肺癌作为一种发病机理复杂、病理复杂、肿瘤生物学行为复杂的癌症，要寻找单独一个高灵敏度和高特异性的标志物的来进行诊断是不现实的。所以一方面在临床上，呼气检测得到的结果可以和其它临床诊断结果一起进行综合分析，以提高其诊断率。而另一方面，单独的呼气检测可以实现良好的重复性和实时监测，而且呼气中的标志物组合模型对肺癌的监测也有一定的准确度，因此在家庭、社区医院等场所可以用于日常的监测和筛选，不需要去医院做复杂的检查，对个人来说节省了时间，降低了费用，对社会来说节省了医疗资源。 与此同时，呼吸检测在临床上可以用于肺癌高危人群的筛选、早期肺癌的诊断、疗效评价、预后判断等方面。在呼气标志物的研究中，针对临床的不同阶段、不同应用，需要找到各种相应的标记物。在未发生肺癌之前，呼气检测的标志物可以对高危人群进行提醒其发生肺癌的风险，从而达到早期干预的效果从根本上降低肺癌发生率；在肺癌的早期阶段，需要有高特异性、高敏感性的标志物组合进行相对低成本的筛选诊断，同时配合CT、X线进行更加精确的诊断；在治疗阶段，需要有呼气中标志物能及时表征治疗效果，以配合医生确定进一步治疗的方案；在预后阶段，也同样需要特定的标志物来进行预后判断，以提高患者的生存率。 未来呼气检测的发展趋势一定会随着人们对健康的需求进行变化，相对应的检测技术也根据具体情况的需要进行不同的发展和创新。 4 总结呼气检测肺癌相比于CT扫描、X线检测不仅具有无副作用的优势，更具有无创、便捷易行、实时监测、患者耐受性好等优势，在肺癌早期诊断、筛选、疗效评价、预后等方面都有一个很好的发展前景。但是目前的呼气检测的方法不仅没有找到公认的标志物用于临床应用，也没有对检测技术进行标准化。因此，肺癌呼气标志物产生机理的探索以及建立标准有效的联合呼气检测方法，将会是呼气诊断肺癌能否实现临床应用的关键。 [参考文献] [1] Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90. [2] Phillips M,Cataneo RN,Cummin AR,et al.Detection of lung cancer with volatile markers in the breath[J].Chest,2003, 123(6):2115-2123. [3] Diederich S,Wormanns D,Semik M,et al.Screening for Early Lung Cancer with Low-Dose Spiral CT: Prevalence in 817 Asymptomatic Smokers 1[J].Radiology,2002,222(3):773-781. [4] Gohagan JK,Marcus PM,Fagerstrom RM,et al.Final results of the Lung Screening Study,a randomized feasibility study of spiral CT versus chest X-ray screening for lung cancer[J].Lung Cancer,2005,47(1):9-15. [5] Hakim M,Broza YY,Barash O,et al.Volatile OrganicCompounds of Lung Cancer and Possible Biochemical Pathways[J].Chem Rev,2012,112(11):5949-5966. [6] Gordon SM,Szidon JP,Krotoszynski BK,et al.Volatile organic compounds in exhaled air from patients with lung cancer[J].Clin Chem,1985,31(8):1278-1282. [7] Phillips M,Gleeson K,Hughes JM,et al.Volatile organic compounds in breath as markers of lung cancer:a crosssectional study[J].Lancet,1999,353(9168):1930-1933. [8] Phillips M,Altorki N,Austin JH,et al.Prediction of lung cancer using volatile biomarkers in breath[J].Cancer Biomark,2007,3(2):95-110. [9] Poli D,Carbognani P,Corradi M,et al.Exhaled volatile organic compounds in patients with non-small cell lung cancer: cross sectional and nested short-term follow-up study[J].Respir Res,2005,6(1):71. [10] Wehinger A,Schmid A,Mechtcheriakov S,et al.Lung cancer detection by proton transfer reaction mass-spectrometric analysis of human breath gas[J].Int J Mass Spectrom,2007, 265(1):49-59. [11] Carpagnano G,Resta O,Foschino-Barbaro MP,et al. Interleukin-6 is increased in breath condensate of patients with non-small cell lung cancer[J].Int J Biol Markers,2001,17(2):141-145. [12] Carpagnano GE,Foschino-Barbaro MP,Resta O,et al.Endothelin-1 is increased in the breath condensate of patients with nonsmall-cell lung cancer[J].Oncology,2004,66(3):180-184. [13] Gessner C,Rechner B,Hammerschmidt S,et al.Angiogenic markers in breath condensate identify non-small cell lung cancer[J].Lung Cancer,2010,68(2):177-184. [14] Zou Y,Wang L,Zhao C,et al.CEA,SCC and NSE levels in exhaled breath condensate--possible markers for early detection of lung cancer[J].J Breath Res,2013,7(4):047101. [15] Carpagnano GE,Foschino-Barbaro MP,Spanevello A,et al.3p microsatellite signature in exhaled breath condensate and tumor tissue of patients with lung cancer[J].Am J Respir Crit Care Med,2008,177(3):337-341. [16] Carpagnano GE,Foschino-Barbaro MP,Spanevello A,et al. Exhaled ERCC-1 and ERCC-2 microsatellite alterations in NSCLC patients[J].Lung Cancer,2010,68(2):305-307. [17] Gessner C,Kuhn H,Toepfer K,et al.Detection of p53 gene mutations in exhaled breath condensate of non-small cell lung cancer patients[J].Lung Cancer,2004,43(2):215-222. [18] Han W,Wang T,Reilly AA,et al.Gene promoter methylation assayed in exhaled breath, with differences in smokers and lung cancer patients[J].Respir Res,2009,10:86. [19] Mozzoni P,Banda I,Goldoni M,et al.Plasma and EBC micro RNAs as early biomarkers of non-small-cell lung cancer[J].Biomarkers,2013,18(8):679-686. Clinical Application of Exhaled Breath Detection for Lung Cancer LIN Li-quan, WANG Fu-yuan, CHEN Xing Abstract：Lung cancer (LC) was the most commonly cancer and had the highest mortality in the world. However, most patients with LC were diagnosed at an advanced stage, thus couldn’t grasp a more treatable stage. Studies showed that the combination of early diagnosis and timely treatment can improve the 5-year survival rate. Therefore the effective method for early diagnosis of LC was urgent needs. Low-dose CT scan and X-ray were by far widely used to early diagnose LC in clinical. These methods did contribute to the early detection of LC, but due to effect of radiation, it would increase the risk of canceration. As a non-invasive and rapid method, exhaled breath detection is a very promising technology and has definite clinical application value in the early diagnosis of LC. [中图分类号]R318.6 [文献标志码]A doi：10.3969/j.issn.1674-1633.2016.02.005 [文章编号]1674-1633(2016)02-0021-04 收稿日期：2015-11-10 基金项目：国家自然科学基金项目（No.81201166，No.81571769）。 通讯作者：陈星，副教授，博士生导师。 Abstract:: exhaled breath detection; lung cancer diagnosis; volatile organic compounds; exhaled breath condensades |