呼气检测技术与设备的研究进展
林丽泉，董浩，王福园，陈星
浙江大学 生物医学工程与仪器科学学院，浙江 杭州 310027
编者按：早在18世纪初，研究人员就发现人呼出气味的不同预示着某些疾病的发生。随着现代医学的发展，呼出气体中有越来越多的疾病相关标志物被发现，最近十几年的研究表明呼出气体中存在可以用于诊断糖尿病、代谢性肥胖、癌症、结核病以及脓毒症等疾病的标志物。在临床应用方面，呼出气检测更是已经成为幽门螺杆菌快速诊断的标准之一。呼出气检测由于其无创检测的优势，可用于疾病的早期发现，病程监测以及预后管理，在临床应用中有着非常巨大的潜力。目前呼出气检测由于疾病标志物产生机理不明，气体采集、分析方法多变，质量控制环节缺失等原因，使得呼出气检测真正用于临床的案例还不多。近年来，呼出气研究呈现出快速增长的趋势，我们相信在可以预见的未来，随着呼出气研究的不断深入，呼出气检测将在临床中占有越来越重要的地位。因此《中国医疗设备》杂志社组织了本专栏介绍呼出气体检测技术的发展现状和临床应用趋势。
栏目主编：陈星
陈星，博士，浙江大学生物医学工程与仪器科学学院副教授，博士生导师。长期从事呼出气体疾病相关标志物的研究和呼出气体检测技术的研发。研究了肺癌呼气标识物的产生机理，发现并报导了肺癌细胞在代谢过程中释放的特定化学物质会通过肺部气体交换存在于肺癌病人的呼出气中，可作为潜在的诊断标识物应用于呼气检测早期肺癌。建立了体检人群中高危人群的呼出气体肺癌筛查平台，为高危因素（如吸烟）对人体的危害及肺癌的发病找到相应的呼出气体标识物，用于肺癌一期预防。研制了呼气采集装置，用于呼出气体的标准化收集。研制了肺癌呼气检测仪成功地从肺癌病人的呼出气中检测出了低于本底浓度的该类标识物。开发了静脉麻醉药异丙酚血药浓度实时监测仪，利用呼出气和血药浓度之间的相关性，实现呼出气在线无创监测异丙酚血药浓度。
[摘 要]呼吸作为人体重要的生理过程，是人体内环境与外界交换物质的途径之一。呼出气体中包含着大量人体新陈代谢的产物，各项研究表明呼出物的种类和浓度在一定程度上能反映人体健康状态。通过检测呼出气中的标志物能及时诊断人体的健康状态，对疾病的发生、发展过程进行监测，从而达到疾病预防的目的。由于呼气检测的无损性，国内外涌现出了许多呼吸检测技术和设备，本文主要介绍了气体采样、进样及预处理技术与设备，复杂混合气体、特定标识物、呼出气中冷凝物的检测技术和设备的研究进展。
[关键词]呼气检测；气体传感器；电子鼻；气相色谱-质谱联用；免疫分析
1 概述
呼吸作为人体重要的生理过程，是人体内环境与外界交换物质的途径之一。呼出气体中包含着大量人体新陈代谢的产物，各项研究表明呼出物的种类和浓度在一定程度上能反映人体的健康状态[1]。比如呼出气中的一氧化氮是国际公认的气道炎症分子标志物。通过检测呼出气中的标志物我们能及时诊断人体的健康状态，对疾病的发生、发展过程进行监测，从而达到疾病预防的目的。目前已有的呼气检测设备有酒精检测仪、幽门螺旋杆菌检测仪等[2]。由于呼气检测的无损性，国内外兴起一股研究和开发呼吸检测技术和设备的热潮。本文就国内外的呼吸检测技术与设备的研究情况展开简要讨论，同时对未来新技术的发展和新设备的开发进行展望。
2 气体采样、进样及预处理技术与设备
呼出气是由未进行气体交换的口鼻腔气道内气体和进行了气体交换的肺泡内气体及部分死腔气体组成。而可作为呼气标识物的有效气体分子应指肺泡内气体，如何最大限度地去除未交换的死腔气体的影响是呼出气采样的关键所在。大多数呼出气标识物的浓度在体积分数ppb至ppt之间。这个浓度等级的气体检测往往已经超出了检测设备的检测下限，因此需要对样本进行必要的浓缩和提纯。而这个过程的控制直接关系到检测的精确性和一致性。
2.1 呼末气体的收集装置
呼出气体的收集主要有两种，一种是用气袋直接采集呼出气，二是利用采气仪将呼出气富集到装填有Tenax的吸附管中。受试者（前者）通过吹嘴装置将呼出气吹入气袋中。后者采用一个抽气气泵和一个流量计数器组成的采气装置将呼出气体中的有机化合物吸附到吸附管中，待后续解吸和分析。比较这两种收集方式，前者更加方便易操作，成本低，但无法排除死腔气体的干扰；后者能有效排除死腔气体的影响，但是成本高且操作较繁琐。
2.2 SPME及TD
与上述气体收集的两种方法相对应，用于浓缩提纯呼出气体以进行后续分析的方法分别有固相微萃取（Solid-Phase Micro-Extraction，SPME）和热脱附仪器（Thermal Desorption，TD）。
固相微萃取技术的原理是采用涂附不同化合物的微型熔融石英萃取纤维吸附气体中的微量有机化合物，然后在高温下将被吸附物质脱附。SPME法不是将待测物全部分离出来，而是通过样品与固相涂层之间的平衡来达到分离目的。分析时，将SPME针插入采完气的气袋中，在一定的温度和一定的时间下萃取气袋中的有机化合物，达到浓缩和提纯目标有机物的目的，萃取完毕后可从GC进样口直接进样。
热脱附仪是对吸附在Tenax管中的物质通过高温加热进行脱附处理，然后吹扫进后续的分析系统中。在热脱附仪的脱附中，一般要采用二级吸附，达到更好的浓缩和提纯的目的。加热时，挥发物从吸附管中释放出来，并被惰性气流带到低温的捕集阱中进行二次吸附。最后，捕集阱被快速加热，同时用载气吹扫，将脱附的挥发物带入气相色谱仪进行分离和分析。这种二级吸附能减少峰扩展，从而改善色谱的分离效率。
3 复杂混合气体检测技术与设备
复杂混合气体的检测能为呼出气疾病标识物的发现和临床诊断效果的验证提供有效的手段，是呼出气代谢组学研究的重要技术支撑。目前检测呼出气中成分的方法主要是基于气相色谱的分离技术和质谱检测技术等。主要的检测设备有：气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）[3]、气相色谱-氢火焰离子化检测器（GC-FID）[4]、气相色谱-离子迁移谱仪（GC-IMS）[5]、选择性离子流管质谱检测仪（SIFTMS）[6]、离子分子质谱检测仪（IMR-MS）[7]、质子转移反应质谱检测仪（PTR-MS）[8]等。
3.1 气相色谱
气相色谱（Gas Chromatography，GC）检测方法已达到皮克以下的检测下限，且具有无可比拟的分离速度和极少的样品量等优点，因而成为分析化学领域中应用最为广泛的方法。气相色谱以惰性气体作为流动相携带样品混合物流过色谱柱，色谱柱中涂覆固定相物质。样品与固定相发生作用，在同一推动力下，不同组分在固定相中滞留的时间不同，依次从固定相中流出。如果色谱柱中涂覆非极性材料（比如硅氧烷），则样品中的混合物是根据其组分的沸点进行分离；若涂覆极性材料则是根据组分的极性进行分离[9]。
色谱作为一种分离技术必须联合其他的检测系统才能对各组分进行定量检测。气相色谱-质谱联用（GC-MS）设备是检测呼出气中挥发性有机化合物（Volatile Organic Compounds，VOCs）最常用的仪器。GC-MS不仅是一种定性检测的重要方法，更可以用于定量检测，一般使用电子电离源（Electron Ionization，EI）作为电离手段。在70 eV条件下轰击检测分子，产生有规律的断裂碎片，用于解析化合物结构，同时对检测未知物质情况，可以检索谱库。氢火焰离子化检测器（Flame Ionization Detector，FID）是毛细管色谱仪中最常用的检测器。其原理是将有机物在氢气和氧气燃烧的火焰下高温电离，然后在高压电场的定向作用下，形成离子流产生电信号用于定量检测。因GC-FID对有机化合物有高灵敏度、宽线性响应范围、低噪声等特点而成为烃类化合物的专用检测仪器。离子迁移谱技术（IMS）工作原理是根据离子在标准大气压下的电场中迁移率的不同进行分离。GC-IMS的联用使混合物经过GC分离后，以单个组分的形式进入到IMS反应区和电离区被电离成离子的状态，离子在迁移区进行二次分离后到达法拉第盘被检测。这种联用手段能够提高检测的准确度。
3.2 质谱检测
质谱检测技术（MS）是依据离子质荷比（质量-电荷比，m/z）来检测。其检测过程是使样品在离子源被电离成不同荷质比的离子，离子经加速电场形成离子束后进入质量分析器，因电场和磁场的作用发生相反的速度色散，被聚焦而得到质谱图，从而确定其质量[10]。由检测过程可知，质谱检测技术包涵电离技术、分析器技术、检测器技术等。目前主要有4种软电离技术：等离子体解吸（PD-MS）[11]、快原子轰击（FAB）[12]、电喷雾（ESI）[13-15]和基质辅助激光解吸/电离（MALDI）[16-17]。随着科技的进步，这4种电离技术都有一定程度的发展。在商品仪器中使用最广泛的质量分析器有扇形磁场、飞行时间质量分析器、四极杆质量分析器、四极杆离子阱和离子回旋共振质量分析器。对于检测器技术而言，质谱有很多种检测器，其中电子倍增管及其阵列、离子计数器、感应电荷检测器、法拉第收集器等是比较常见的检测器。
选择性离子流管质谱检测（SIFT-MS）是一种将初始离子（比如H3O+、NO+、O2+等）和由载气导入的痕量气体在一定时间内进行化学电离的技术。由于所使用的初始离子和大多数痕量气体的分子可进行快速反应，因此，该检测仪器可以用于呼吸的实时在线检测，而且即使是虚弱的病人也可以进行该仪器的呼吸检测。质子转移反应质谱检测（PTR-MS）是在SIFT-MS技术上发展起来的技术，该技术也可以用于在线检测。它通常采用H3O+作为初始离子，通过与有机物分子的质子转移反应生成准分子离子，然后利用质谱检测技术来确定有机物的绝对浓度。除此之外，质谱检测技术还发展了离子分子质谱检测仪（IMR-MS）、多质子吸收激光诱导解离质谱（REMPI-MS）[18]、单光子电离质谱（SPI-MS）[19]等。
4 特定标识物的检测技术与设备
上述对于复杂气体检测的技术与设备由于体积庞大，单样品分析时间长，分析成本高等缺点，不利于对某些特定疾病标识物进行快速检测，因此根据临床快速检测的需求，往往需要开发成本低、分析快、疾病指标明确的呼出气检测技术和设备。基于传感器技术的检测设备能对单一或者特定几种呼气标识物进行快速有效、低成本检测，以符合临床应用需求。
4.1 电子鼻检测技术
电子鼻检测技术是基于传感器的检测技术，目前用于检测呼出气的传感器有半导体金属氧化物（MOS）气体传感器、声表面波（SAW）传感器、石英晶体微天平（QCM）传感器、纳米金颗粒电阻式传感器、色度传感器等。利用传感器进行检测具有快速、简便、低成本等特点。
4.1.1 MOS气体传感器
MOS传感器在检测小分子质量的挥发性有机物时结果显著，比如检测氨气、丙酮、乙醇、甲醇、异戊二烯等[20]。MOS有多种不同的器件类型，如表面电阻控制型气敏器件、烧结型气敏器件和体电阻控制型气敏器件等。在某些电子鼻的设计中采用的TGS或者MQ系列金属氧化物半导体气体传感器都是以SnO2（Tin Dioxide）作为敏感材料，并以厚膜工艺加工制造而成的。
4.1.2 基于压电材料的气体传感器
SAW传感器[21]和QCM传感器[22]都属于质量敏感型压电传感器，可用于检测大分子质量的挥发性有机物。但由于SAW的基频可以达到GHZ的水平，远大于QCM的几十MHz，所以SAW传感器比QCM传感器的检测下限更低，更为灵敏。其次不管是SAW还是QCM，其本身对气体不具有选择性，需要依赖于表面涂覆物质的性质来表示选择性。
4.1.3 纳米金颗粒电阻式传感器
纳米金颗粒电阻式传感器的工作原理是在不同气体环境中传感器的电阻特性会发生改变[23]。由于其在叉指之间沉积的纳米金颗粒中的金属物质提供电导，而金属表面的不导电有机配体则提供与有机气体分子结合的位点，故其选择性可以通过调整有机配体或者官能团来实现与待检测特异性气体的结合。
4.1.4 色度传感器
与传统的检测电信号的传感器不同的是，色度传感器通过检测光的特性来确定物质[24]。其原理是当基底上的敏感材料与化学物质结合时发生颜色的变化，通过进行前后对比其颜色种类、深浅度等来确定物质类别。这样不仅可以省略传统传感器后续的复杂电路，更使测量结果直观易懂。
同时为了提高传感器的灵敏度，以上所列的传感器基本都是以传感器阵列的形式集成在同一芯片上对呼出气进行检测，通过对传感器阵列测得的混合气体物质信号进行解码分析得到物质成分及其浓度。这种采用模式识别进行信号处理的方法被形象地称为“电子鼻”[25-26]。基于传感器检测技术研发的电子鼻是一种快速检测的新型设备。与传统的GC-MS检测相比虽然检测物的范围受限于传感器类型的选择，但是检测时间和检测速度方面均有较大提升。
4.2 基于光学原理的呼吸检测技术与设备
激光光谱技术是一种可以检测超低浓度的高分辨率检测技术。其检测过程是以激光作为光源，将待检测物注入光腔中，当激光通过光腔会被特定物质所吸收，于是在检测器端通过检测激光被吸收的量来确定物质的浓度[27-28]。相比于传统的检测方法，其优势不仅在于可以进行实时检测，而且可以省去检测样品进行类似离子化的处理过程。
基于激光光谱技术发展起来的技术包括腔衰荡光谱（Cavity Ring-Down Spectroscopy，CRDS）技术[29]、腔增强光谱（Cavity-Enhanced Spectroscopy，CES）技术[30]、腔漏光谱（Cavity Leak-out Spectrometer，CLS）技术[31]，法拉第调制光谱（Faraday Modulation Spectroscopy，FMS）技术[32]等。由于目前的激光光谱检测系统的多样性和复杂性，目前还难以广泛应用于临床研究。但仍有不少研究使用激光光谱技术检测呼出物中的氨气、乙烷、甲醛、乙醛、氮氧化合物等[33-34]。由于其具有高光谱分辨率、高时间分辨率、高空间分辨率、高激发选择性、高分析灵敏度以及测试效率等优点，激光光谱学技术拥有巨大的潜力。在未来的发展中，该技术一定会是呼气检测的重要手段之一。
5 呼出气中冷凝物的检测技术和设备
呼出物的检测除了直接对气体进行检测，还有针对呼出气体冷凝物（Exhaled Breath Condensate，EBC）的检测[35]。研究发现，气道黏膜液、相对分子质量较小的蛋白质和挥发性物质会在安静的呼吸中一起被呼出，所以EBC中含有微量蛋白质[36-37]、DNA[38-39]、MicroRNA[40]等物质，而这些物质也能一定程度的反映人体的健康状态。所以近些年国内外也掀起一股EBCs检测研究的热潮。
5.1 EBC的收集技术和设备
EBC指的是在通过冷凝呼出气得到的低挥发或者不挥发的物质，所以EBC的收集原理就是冷凝技术。正常的呼出气温度大约是37 ℃，且充满了水蒸气，当外界温度降到-10 ℃，93.7%的水蒸气会变成冷凝物，且非挥发性物质会被冷凝在其中。
市场上现有的EBC收集器有4种，分别是德国Eric Jaeger公司生产的EcoScreen®收集器[41]、美国Respiratory Research生产的RTube™[42]、意大利MediVac公司生产的TurboDeccs[43]以及西班牙Biostec公司生产的Anacon[44]收集器。其中前两种被使用的比较多，第一种具有较为精确的收集效果但体积较大，第二种则是面向于家庭和社区，轻巧便携。研究表明不同的收集器的收集效果差距很大[45]，由不同收集器收集的EBCs之间没有可比性。
5.2 EBCs的检测技术和设备
对于检测EBC中的蛋白质，采用多是基于标记免疫分析技术，包括放射性免疫分析（RIA）法[46-47]、酶免疫分析（EIA）法[48-49]、化学发光免疫分析（CLIA）法[50-51]以及时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）法[52-53]。
RIA的原理是使放射性标记抗原和未标记抗原（待测物）与不足量的特异性抗体竞争性地结合，反应后分离并测量放射性，从而求得未标记抗原的量。虽然RIA操作简便、成本低，但其具有放射性污染问题。为了解决放射性的问题，EIA、CLIA等技术发展起来并得到广泛的应用。EIA是一种非放射性标记免疫分析技术，以酶标记抗原或抗体作为示踪物，由高活性的酶催化底物显色或发光，达到定量分析的目的。EIA不仅操作简便，不污染环境，而且酶标记物十分稳定，有效期长，所以应用范围广泛。其中，酶联免疫吸附测定法（ELISA）[54]是EIA的主要方法之一。同样的，CLIA也是一种非放射性标记免疫分析技术，包涵免疫反应系统和化学发光系统。其原理是用化学发光剂直接标记抗原或抗体，标记后的抗原与抗体经免疫反应后加入起动发光的试剂，通过检测光强度来检测待测物的含量。化学发光酶免疫（CLEIA）分析、增强发光酶免疫（ELEIA）分析等都是对CLIA技术的发展。此外，CLIA的自动化检测的实现也极大地提高了检测效率，降低了人为误差。虽然EIA和CLIA不具有放射性问题，但其灵敏度不能够同RIA匹敌。为解决这个问题，TRFIA应运而生，它也是一种非放射性免疫技术且其灵敏度可以与RIA媲美。TRFIA用镧系金属离子（比如Eu3+、Tb3+和Sm3+）作为示踪物标记抗原或抗体，然后与其螯合剂、增强液一起经过免疫反应后，用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度，根据荧光强度和相对荧光强度比值，确定待测物的浓度。与CLIA一样，TRFIA也实现了自动化的检测。除了这4种基本的标记免疫方法，还有报道采用液相色谱质谱（LCMS）[55]、基于场效应晶体管（FET）的生物传感器[56]、双色荧光的量子点[57]、基于乐辅波声表面波的免疫传感器[58]等方法进行蛋白质的检测。
此外，对于检测EBC中的DNA采用的多为PCR扩增联合基因检测技术。而MicroRNA的扩增技术有逆转录PCR技术[59]、RNA印迹法[60]、RNA原位杂交[61]等，其检测技术有单分子测序[62]、表面增强拉曼光谱[63]、表面等离子体共振光谱[64]、纳米机械传感[65]以及单银纳米颗粒计数[66]等。
6 总结与展望
随着人们生活水平的提高，对健康监测的需求也越来越大，呼气检测作为快速无损的检测手段在市场上得到很大的青睐。对于呼气的气体检测，一些传统的检测方法不仅效率低、速度慢，而且费用高，但分析精度高，适合用于分析一些复杂混合物的成分。一旦各项研究确定某些和机体的疾病或者紊乱相关的标志物，采用传感器为基础的呼气检测设备来检测具体的标志物是一种选择趋势，不仅速度快，而且费用低，同时也能保证一定的准确率。当呼气检测应用于家庭社区等场合，呼气检测设备需要更加便携易操作；而当其应用于临床监测，则需要实现在线实时检测。
[参考文献]
[1] Kim KH,Jahan SA,Kabir E.A review of breath analysis for diagnosis of human health[J].Trac-Trend Anal Chem,2012,33:1-8.
[2] Gisbert JP,Pajares JM.Review article:13C-urea breath test in the diagnosis of Helicobacter pylori infection–a critical review[J].Aliment Pharmacol Ther,2004,20(10):1001-1017.
[3] Pleil JD,Lindstrom AB.Exhaled human breath measurement method for assessing exposure to halogenated volatile organic compounds[J].Clin Chem,1997,43(5):723-730.
[4] Mendis S,Sobotka PA,Euler DE.Pentane and isoprene in expired air from humans:gas-chromatographic analysis of single breath[J].Clin Chem,1994,40(8):1485-1488.
[5] Hornuss C,Praun S,Villinger J,et al.Real-time monitoring of propofol in expired air in humans undergoing total intravenous anesthesia[J].Anesthesiology,106(4):665-674.
[6] Spaněl P,Smith D.Progress in SIFT-MS:breath analysis and other applications[J].Mass Spectrom Rev,2011,30(2):236-267.
[7] Schubert H,Guntow U,Hofmann K,et al.Performance and application potential of ion-molecule reaction mass spectrometry (IMR-MS) in the analysis of complex gas mixtures[J].Bioanal Chem,1996,356(2):127-137.
[8] Smith D,Spanel P.Direct,rapid quantitative analyses of BVOCs using SIFT-MS and PTR-MS obviating sample collection[J].Trac-Trend Anal Chem,2011,30(7):945-959.
[9] Ghoos Y,Hiele M,Rutgeerts P,et al.Porous-layer open-tubular gas chromatography in combination with an ion trap detector to assess volatile metabolites in human breath[J].Biomed Environ Mass Spectrom,1989,18(8):613-616.
[10] Chen Z,Meiping Z.Methodsfor detection of volatile organic compounds in human exhaled breath[J].Prog Chem,2010,22(1): 140-147.
[11] Zhang Y,Ma X,Zhang S,et al.Direct detection of explosives on solid surfaces by low temperature plasma desorption mass spectrometry[J].Analyst,2008,134(1):176-181.
[12] Gross JH.Fast Atom Bombardment, in Mass Spectrometry[M]. Springer,2004:381-410.
[13] King R,Bonfiglio R,Fernandez-Metzler C,et al.Mechanistic investigation of ionization suppression in electrospray ionization[J].J Am Soc Mass Spectrom,2000,11(11):942-950.
[14] Yamashita M,Fenn JB.Electrospray ion source.Another variation on the free-jet theme[J].J Phys Chem,1984,88(20): 4451-4459.
[15] Takáts Z,Wiseman JM,Cooks RG.Ambient mass spectrometry using desorption electrospray ionization (DESI):instrumentation, mechanisms and applications in forensics,chemistry,and biology[J].J Mass Spectrom,2005,40(10):1261-1275.
[16] Fenselau C,Demirev PA.Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spectrometry[J].Mass Spectrom Rev,2001, 20(4):157-171.
[17] Suckau D,Resemann A,Schuerenberg M,et al.A novel MALDI LIFT-TOF/TOF mass spectrometer for proteomics[J].Anal Bioanal Chem,2003,376(7):952-965.
[18] Taubitz J,Lüning U,Grotemeyer J.Multiple hydrogen bonds. Mass spectra of hydrogen bonded heterodimers. A comparison of ESI-and REMPI-ReTOF-MS[J].Chem Commun(Camb), 2004,(21):2400-2401.
[19] Streibel T,Geissler R,Saraji-Bozorgzad M,et al.Evolved gas analysis (EGA) in TG and DSC with single photon ionisation mass spectrometry (SPI-MS):molecular organic signatures from pyrolysis of soft and hard wood, coal, crude oil and ABS polymer[J].J Therm Anal Calorim,2009,96:795-804.
[20] Wang D,Yu K,Wang Y,et al.A Hybrid Electronic Noses' System Based on Mos-Saw Detection Units Intended for Lung Cancer Diagnosis[J].J Innov Opt Heal Sci,2012,5(1):1150006.
[21] Chen X,Cao M,Li Y,et al.A study of an electronic nose for detection of lung cancer based on a virtual SAW gas sensors array and imaging recognition method[J].Meas Sci Technol,2005,16(8):1535.
[22] Ishida H,Satou T,Tsuji K,et al.The breath ammonia measurement of the hemodialysis with a QCM-NH3 sensor[J].Biomed Mater Eng,2008,18(2):99-106.
[23] Peng G,Tisch U,Adams O,et al.Diagnosing lung cancer in exhaled breath using gold nanoparticles[J].Nat Nanotechnol, 2009,4(10):669-673.
[24] Mazzone PJ,Hammel J,Dweik R,et al.Diagnosis of lung cancer by the analysis of exhaled breath with a colorimetric sensor array[J].Thorax,2007,62(7):565-568.
[25] Röck F,Barsan N,Weimar U.Electronic nose: current status and future trends[J].Chem Rev,2008,108(2):705-725.
[26] Zohora SE,Khan A,Hundewale N.Chemical Sensors Employed in Electronic Noses:A Review,in Advances in Computing and Information Technology[M].Springer,2013:177-184.
[27] Lee PS,Majkowski RF,Perry TA.Tunable diode laser spectroscopy for isotope analysis--detection of isotopic carbon monoxide in exhaled breath[J].IEEE Trans Biomed Eng,1991,38(10):966-973.
[28] Wang CJ,Sahay P.Breath Analysis Using Laser Spectroscopic Techniques:Breath Biomarkers,Spectral Fingerprints,and Detection Limits[J].Sensors,2009,9(10):8230-8262.
[29] LaFranchi B.Cavity Ring Down Spectroscopy:History, Fundamentals, and Applications[D].Vermont:University of Vermont,2003.
[30] Mazurenka M,Orr-Ewing AJ,Peverall R,et al.4 Cavity ring-down and cavity enhanced spectroscopy using diode lasers[J].Annu Rep Prog Chem,Sect C:Phys Chem,2005,101(1):100-142.
[31] Dahnke H,Kleine D,Hering P,et al.Real-time monitoring of ethane in human breath using mid-infrared cavity leak-out spectroscopy[J].Appl Phys B-Lasers O,2001,72(8):971-975.
[32] Ganser H,Urban W,Brown AM.The sensitive detection of NO by Faraday modulation spectroscopy with a quantum cascade laser[J].Mol Phys,2003,101(4-5):545-550.
[33] Bakhirkin YA,Kosterev AA,Curl RF,et al.Sub-ppbv nitric oxide concentration measurements using cw thermoelectrically cooled quantum cascade laser-based integrated cavity output spectroscopy[J].Appl Phys B-Lasers O,2006,82(1):149-154.
[34] Roller CB,Holland BP,Mcmillen G,et al.Measurement of exhaled nitric oxide in beef cattle using tunable diode laser absorption spectroscopy[J].Appl Optics,2007,46(8):1333-1342.
[35] Hunt J.Exhaled breath condensate:an evolving tool for non-invasive evaluation of lung disease[J].J Allergy Clin Immunol,2002,110(1):28-34.
[36] Carpagnano GE,Foschino-Barbaro MP,Resta O,et al.Endothelin-1 is increased in the breath condensate of patients with non-smallcell lung cancer[J].Oncology,2004,66(3):180-184.
[37] Gessner C,Rechner BS,Kuhn H,et al.Angiogenic markers in breath condensate identify non-small cell lung cancer[J].Lung Cancer,2010,68(2):177-184.
[38] Carpagnano GE,Maria Pia FB,Antonio S,et al.3p microsatellite signature in exhaled breath condensate and tumor tissue of patients with lung cancer[J].Am J Respir Crit Care Med,2008, 177(3):337-341.
[39] Gessner C,Kuhn H,Toepfer K,et al.Detection of p53 gene mutations in exhaled breath condensate of non-small cell lung cancer patients[J].Lung Cancer,2004,43(2):215-222.
[40] Paola M, Iris B,Matteo G,et al.Plasma and EBC microRNAs as early biomarkers of non-small-cell lung cancer[J].Biomarkers, 2013,18(8):679-686.
[41] Tufvesson E,Bjermer L,Ekberg M.Patients with chronic obstructive pulmonary disease and chronically colonized with Haemophilus influenzae during stable disease phase have increased airway inflammation[J].Int J Chronic Obstr, 2015,10:881.
[42] Bloemen K,Van DHR,Govarts E,et al.A new approach to study exhaled proteins as potential biomarkers for asthma[J].Clin Exp Allergy,2011,41(3):346-356.
[43] Corradi M,Folesani G,Gergelova P,et al.Effect of Salt-Bromide-Iodine Thermal Water Inhalation on Functional and Biochemical Lung Parameters[J].ISRN Pulmonology,2012,2012:1-8.
[44] Izquierdo-García J,Peces-Barba G,Heili S,et al.Is NMR-based metabolomic analysis of exhaled breath condensate accurate[J]?Eur Respir J,2011,37(2):468-470.
[45] Czebe K,Barta I,Antus B,et al.Influence of condensing equipment and temperature on exhaled breath condensate pH,total protein and leukotriene concentrations[J].Respir Med,2008,102(5):720-725.
[46] Cooper EH,Splinter TA,Brown DA,et al.Evaluation of a radioimmunoassay for neuron specific enolase in small cell lung cancer[J].Br J Cancer,1985,52(3):333-338.
[47] Lahner E,Vaira D,Figura N,et al.Role of noninvasive tests (13C-urea breath test and stool antigen test) as additional tools in diagnosis of Helicobacter pylori infection in patients with atrophic body gastritis[J].Helicobacter,2004,9(5):436-442.
[48] Andersen L,Dinesen B,Jørgensen PN,et al.Enzyme immunoassay for intact human insulin in serum or plasma[J].Clin Chem,1993,39(4):578-582.
[49] Engvall E.Enzyme immunoassay ELISA and EMIT[J].MethodsEnzymol,1980,70:419-439.
[50] Bhattacharyya A,Klapperich CM.Design and testing of a disposable microfluidic chemiluminescent immunoassay for disease biomarkers in human serum samples[J].Biomed Microdevices,2007,9(2):245-251.
[51] Bi S,Zhou H,Zhang S.Multilayers enzyme-coated carbon nanotubes as biolabel for ultrasensitive chemiluminescence immunoassay of cancer biomarker[J].Biosens Bioelectron,2009,24(10):2961-2966.
[52] Tang D,Wang YC,Chang WB,et al.Time-resolved fluorescence immunoassay of estradiol in serum[J].Fenxi Huaxue,1999,27 (8):899-903.
[53] Wu FB,He YF,Han SQ.Matrix interference in serum total thyroxin(T4)time-resolved fluorescence immunoassay(TRFIA) and its elimination with the use of streptavidin–biotin separation technique[J].Clin Chim Acta,2001,308:117-126.
[54] Lequin RM.Enzyme immunoassay(EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)[J].Clin Chem,2005,51(12): 2415-2418.
[55] Zeng X,Hood BL,Sun M,et al.Lung Cancer Serum Biomarker Discovery Using Glycoprotein Capture and Liquid Chromatography Mass Spectrometry[J].J Proteome Res,2010,9(12):6440-6449.
[56] Cheng S,Hotani K,Hideshima S,et al.Field Effect Transistor Biosensor Using Antigen Binding Fragment for Detecting Tumor Marker in Human Serum[J].Materials,2014,7(4):2490.
[57] Li H,Cao Z,Zhang Y,et al.Simultaneous detection of two lung cancer biomarkers using dual-color fluorescence quantum dots[J].Analyst,2011,136(7):1399-1405.
[58] Zhang X,Zou YC,An C,et al.A miniaturized immunosensor platform for automatic detection of carcinoembryonic antigen in EBC[J].Sensor Actuat B-Chem,2014,205:94-101.
[59] Markou A,Tsaroucha EG,Kaklamanis L,et al.Prognostic value of mature microRNA-21 and microRNA-205 overexpression in non-small cell lung cancer by quantitative real-time RTPCR[J].Clin Chem,2008,54(10):1696-1704.
[60] Várallyay E,Burgyán J,Havelda Z.MicroRNA detection by northern blotting using locked nucleic acid probes[J].Nat Protoc,2008,3(2):190-196.
[61] Lim LP,Lau NC,Garrett-Engele P,et al.Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs[J].Nature,2005,433(7027):769-773.
[62] Neely LA,Patel S,Garver J,et al.A single-molecule method for the quantitation of microRNA gene expression[J].NatMethods,2005,3(1):41-46.
[63] Driskell JD,Seto AG,Jones LP,et al.Rapid microRNA (miRNA) detection and classification via surface enhanced Raman spectroscopy (SERS)[J].Biosens Bioelectron,2008,24:923-928.
[64] Harris TD,Buzby PR,Babcock H,et al.Single-molecule DNA sequencing of a viral genome[J].Science,2008,320:106-109.
[65] Husale S,Persson HH,Sahin O.DNA nanomechanics allows direct digital detection of complementary DNA and microRNA targets[J].Nature,2009,462(7276):1075-1078.
[66] Xu F,Dong C,Xie C,et al.Ultrahighly Sensitive Homogeneous Detection of DNA and MicroRNA by Using Single-Silver-Nanoparticle Counting[J].Chemistry,2010,16(3):1010-1016.
Progress in Technology and Equipment of Exhaled Breath Detection
LIN Li-quan, DONG Hao, WANG Fu-yuan, CHEN Xing
College of Biomedical Engineering and Instrument Science, Zhejiang University, Hangzhou Zhejiang 310027, China
Abstract：As an important physiological process for human beings, breathing is one of the most important ways to exchange substances between the human body environment and the outside world. Various studies suggested that the type and concentration of the exhaled breath that contains a large number of metabolic products, have close relationships with human health. Nitric oxide, one kind of exhaled gas, is an internationally recognized molecular markers of airway inflammation. Through detecting the exhaled markers, we can promptly detect the body's health condition, and monitor the occurrence and development of diseases, so as to achieve the purpose of disease prevention. Due to the non-invasive, exhaled breath detection technology and equipment emerged in large numbers both at home and abroad.
[中图分类号]R318.6
[文献标志码]A
doi：10.3969/j.issn.1674-1633.2016.02.003
[文章编号]1674-1633(2016)02-0011-07
收稿日期：2015-11-10
基金项目：国家自然科学基金项目（No.81201166，No.81571769）；教育部博士点基金项目（No.20120101120165）。
通讯作者：陈星，副教授，博士生导师。
Abstract:: exhaled breath detection; gas sensors; electronic nose; gas chromatography mass spectrography; immunoassay